[發(fā)明專利]一種甲氨蝶呤均相酶免疫檢測試劑及其制備和檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510039620.0
• 申請日: 2015-01-27
• 公開（公告）號(hào): CN104569373A
• 公開（公告）日: 2015-04-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 虞留明;盧忠心;胡瑜;婁金麗;成志鵬
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州博源醫(yī)療科技有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/531
• 分類號(hào): G01N33/531;G01N33/544
• 代理公司: 南京縱橫知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 32224
• 代理人: 董建林

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種甲氨蝶呤檢測試劑及其制備和檢測方法，具體涉及一種甲氨蝶呤均相酶免疫檢測試劑及其制備和檢測方法。

背景技術(shù)

甲氨蝶呤(Methotrexate)結(jié)構(gòu)式如式(Ⅲ)所示：

甲氨蝶呤是一種葉酸還原酶抑制劑，為抗葉酸類抗腫瘤藥物，主要通過對二氫葉酸還原酶的抑制作用阻礙腫瘤細(xì)胞DNA的合成，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長和繁殖。其選擇性地作用于S期，屬于細(xì)胞周期特異性藥物。臨床上在急性白血病(尤其是急性淋巴細(xì)胞性白血病)、絨毛膜上皮癌及惡性葡萄胎等方面治療效果較好。對頭頸部腫瘤、乳腺癌、肺癌及盆腔腫瘤均有一定療效，也可與其他藥物聯(lián)合治療Burkitts淋巴瘤，晚期淋巴肉瘤(Ⅲ和Ⅳ期，Peter氏階段系統(tǒng))和晚期蕈樣真菌病。甲氨蝶呤安全范圍窄，服藥后人體代謝和排泄的個(gè)體化差異大，低于其有效血藥濃度無法抑制腫瘤生長，高于其有效血藥濃度則會(huì)引起胃腸道反應(yīng)、肝硬化、腎臟損害等副作用。該藥細(xì)胞毒性較大，不良反應(yīng)較多，應(yīng)密切監(jiān)測患者血藥濃度，做到個(gè)體化給藥。因此，對服用甲氨蝶呤的患者進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測，對減少不良反應(yīng)及指導(dǎo)臨床個(gè)體化安全用藥具有重要意義。

目前，測定甲氨蝶呤的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、熒光偏振免疫分析法(FPIA)等，HPLC法操作繁瑣，主要用于實(shí)驗(yàn)室分析，F(xiàn)PIA法需要配備昂貴的專用儀器，成本較高。因此，這些方法在臨床應(yīng)用上都具有一定的缺陷性。國外廠家雖然已有可應(yīng)用于生化分析儀的甲氨蝶呤測定試劑盒上市，但產(chǎn)品數(shù)量遠(yuǎn)不能滿足臨床需求。目前市場上仍缺乏穩(wěn)定性好、靈敏度高、特異性強(qiáng)的甲氨蝶呤檢測試劑，尤其是質(zhì)量好的自動(dòng)化檢驗(yàn)試劑。因此，研發(fā)生產(chǎn)質(zhì)量達(dá)到臨床要求、實(shí)用性強(qiáng)、性價(jià)比高，可應(yīng)用于全自動(dòng)生化分析儀的甲氨蝶呤測定試劑已成為國內(nèi)外體外診斷試劑行業(yè)的熱點(diǎn)。本發(fā)明的甲氨蝶呤均相酶免疫檢測試劑可以實(shí)現(xiàn)在全自動(dòng)生化分析儀上對甲氨蝶呤的高通量、快速化檢測，且具有操作簡便、靈敏度高、特異性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，還能有效降低甲氨蝶呤檢測成本，有利于臨床推廣使用。

發(fā)明內(nèi)容

為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種既安全又可快速、高效、靈敏、準(zhǔn)確檢測出待測樣本中甲氨蝶呤含量的甲氨蝶呤均相酶免疫檢測試劑及其制備方法，以及可以與各種類型的自動(dòng)生化分析儀聯(lián)用、對檢測人員要求不高的甲氨蝶呤均相酶免疫檢測方法。

本發(fā)明的另一個(gè)目的為提供一種有助于制備快速準(zhǔn)確地測定甲氨蝶呤含量的甲氨蝶呤均相酶免疫檢測試劑的甲氨蝶呤衍生物。

為了實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種甲氨蝶呤均相酶免疫檢測試劑，其特征在于，包括：抗甲氨蝶呤特異性抗體、用于檢測抗甲氨蝶呤特異性抗體-甲氨蝶呤復(fù)合物的指示試劑；上述抗甲氨蝶呤特異性抗體由甲氨蝶呤免疫原免疫動(dòng)物得到，甲氨蝶呤免疫原的結(jié)構(gòu)式如式(Ⅰ)所示：

式中，載體為具有免疫原性的蛋白質(zhì)，優(yōu)選為血清蛋白、血藍(lán)蛋白或甲狀腺球蛋白；上述指示試劑選自酶試劑、放射性同位素試劑、熒光試劑或化學(xué)發(fā)光試劑。

前述的甲氨蝶呤均相酶免疫檢測試劑，上述指示試劑選自酶試劑，包括：酶標(biāo)偶聯(lián)物和酶的底物；上述酶標(biāo)偶聯(lián)物包括葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原酶標(biāo)偶聯(lián)物；上述酶的底物為葡萄糖-6-磷酸。

前述的甲氨蝶呤均相酶免疫檢測試劑，上述葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原酶標(biāo)偶聯(lián)物由葡萄糖-6-磷酸脫氫酶與甲氨蝶呤衍生物反應(yīng)形成，上述甲氨蝶呤衍生物的結(jié)構(gòu)式如式(Ⅱ)所示：

甲氨蝶呤衍生物，結(jié)構(gòu)式如式(Ⅱ)所示：

其合成路線為：

一種甲氨蝶呤均相酶免疫檢測試劑的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)甲氨蝶呤衍生物的合成與純化，并進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定；

(2)甲氨蝶呤免疫原的合成：使甲氨蝶呤的末端羧基與具有免疫原性的蛋白質(zhì)載體連接；

(3)用甲氨蝶呤免疫原免疫動(dòng)物，制備并純化抗甲氨蝶呤特異性抗體；

(4)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原偶聯(lián)物的制備：制備葡萄糖-6-磷酸脫氫酶溶液，制備甲氨蝶呤衍生物溶液，使葡萄糖-6-磷酸脫氫酶與甲氨蝶呤的末端羧基連接，純化連接產(chǎn)物；

(5)甲氨蝶呤均相酶免疫檢測試劑的制備：