[發(fā)明專利]表達豬pCD163的細胞系、其制備方法及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510027577.6
• 申請日: 2015-01-20
• 公開（公告）號: CN104593331B
• 公開（公告）日: 2017-07-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 杜以軍;王金寶;叢曉燕;陳蕾;齊靜;孫文博;吳家強;陳智;于江;郭立輝;任素芳
• 申請（專利權(quán)）人: 山東省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N7/00;A61K39/12;A61P31/14
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務(wù)所37218
• 代理人: 劉麗

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)中基因表達領(lǐng)域，特別涉及一種表達豬pCD163的細胞系，還涉及此細胞系的制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS），俗稱“豬藍耳病”，由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）引起，病毒感染后可以導(dǎo)致母豬流產(chǎn)、返情、產(chǎn)死胎或弱仔、仔豬死亡及各種年齡的豬不同程度的呼吸道癥狀，并且能破壞豬的免疫系統(tǒng)，引起混合感染或繼發(fā)感染。我國于1995年底爆發(fā)此病，并迅速蔓延到全國多個省份。在許多規(guī)模化豬場，PRRS陽性率很高，有的可達80%以上。自2006年以來，我國部分地區(qū)豬場發(fā)生了由PRRSV變異株導(dǎo)致的高致病性藍耳病。該病在臨床上以發(fā)病豬高熱、呼吸困難、皮膚發(fā)紅為主要特征，具有更高的發(fā)病率和死亡率，給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了極為嚴重的經(jīng)濟損失。現(xiàn)階段使用疫苗免疫仍是防制PRRS流行的主要手段。

PRRSV表現(xiàn)出相當嚴格的細胞嗜性，PRRSV在感染豬體時，其主要的靶細胞為肺泡巨噬細胞（PAM），在體外培養(yǎng)時，則只能在CL2621、MARC-145等細胞中增殖。PAM非常容易感染PRRSV，但是PAM難于獲得且只能原代培養(yǎng)，操作成本高昂，無法在PRRSV的疫苗生產(chǎn)中使用；MARC-145細胞雖然可以增殖PRRSV，但是存在著增殖PRRSV速度慢、PRRSV滴毒低的局限性。

CD163是PRRSV細胞受體，可以單獨介導(dǎo)PRRSV的吸附和內(nèi)吞。研究發(fā)現(xiàn)，將 CD163分子導(dǎo)入PRRSV非易感細胞，使該細胞表達CD163蛋白后就能夠感染并增殖PRRSV，成為PRRSV易感細胞。CD163在MARC-145細胞中的表達量很低，導(dǎo)致了MARC-145細胞增殖PRRSV速度慢、PRRSV滴毒低。

公開號為CN103525773A的中國發(fā)明專利申請，公開了一種提高豬藍耳病病毒靶細胞感染滴度的方法及其應(yīng)用。通過構(gòu)建能夠表達豬藍耳病病毒受體硫酸乙酰肝素、 唾液酸粘附素、 波形蛋白、CD163、CD151和非肌肉肌球蛋白重鏈Ⅱ A受體中的單個或多個的Marc145細胞或MA-104細胞，再利用該細胞接種豬藍耳病病毒，收集病毒液，豬藍耳病病毒感染滴度得到大幅提高；收集的病毒液可進一步用于藍耳病疫苗生產(chǎn)。說明書中具體實施方式詳細公開了細胞系的構(gòu)建方法及病毒培養(yǎng)效價，構(gòu)建過程中使用的載體為pIRES2-EGFP。利用能表達豬藍耳病病毒受體細胞接種病毒，可連續(xù)收獲病毒且收獲病毒滴度提高2～5倍，而所制備疫苗的效力并沒有降低，在不增加額外生產(chǎn)成本的基礎(chǔ)上，使單位時間產(chǎn)能提高2～5倍。本發(fā)明人認為，上述效果還有進一步提升的空間。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決以上現(xiàn)有技術(shù)中pCD163在MARC-145細胞中的表達量低，導(dǎo)致了MARC-145細胞增殖PRRSV速度慢、PRRSV滴毒低的問題，本發(fā)明提供了一種可以在病毒滴度較低的情況下快速、高效地增殖PRRSV的表達豬pCD163的細胞系pCD163-MARC。

本發(fā)明還提供了所述細胞系pCD163-MARC的制備方法。

本發(fā)明還提供了所述細胞系pCD163-MARC的應(yīng)用。

本發(fā)明是通過以下步驟得到的：

一種表達豬pCD163的細胞系，通過以下步驟得到的：

通過RT-PCR擴增獲得pCD163受體基因，將其插入真核表達載體pCI-neo中，構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pCI-pCD163，將真核表達質(zhì)粒pCI-pCD163轉(zhuǎn)染MARC-145細胞，通過G418進行抗性篩選，獲得單克隆細胞并擴大培養(yǎng)即得。

根據(jù)GenBank公布的pCD163的基因序列（GenBank No: HM991330）設(shè)計一對擴增pCD163受體基因序列的引物，序列如下：

pCD163-Fwd(XhoI): 5’-ATACTCGAGCCACCATGGACAAACTCAGAATGGTGCTAC-3’，

pCD163-Rev(NotI): 5’-ATAGCGGCCGCAAGCTTATCATTGTACTTCAGAG-3’。