[發明專利]檢測食品中沙門氏菌的有擴增內標的PCR方法及試劑盒

在審

• 申請號: 201510014556.0
• 申請日: 2015-01-09
• 公開（公告）號: CN104593495A
• 公開（公告）日: 2015-05-06
• 發明（設計）人: 張德福;勵建榮;張明;付緒磊;曹愛玲;徐永霞;劉雪飛;湯軼偉;高雪;李春
• 申請（專利權）人: 渤海大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/42
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種檢測食品中沙門氏菌的有擴增內標的PCR方法及試劑盒。

背景技術

沙門氏菌引起的沙門氏菌病是公共衛生學上具有重要意義的人畜共患病之一，是常見、多發、危害較大的細菌性食源性疾病。一些國家沙門氏菌引起的食源性疾病占細菌性食源性疾病總數的40％-60％。我國每年都有很多沙門氏菌引起的食源性疾病的發生，嚴重地危害人民群眾的食品安全與身體健康。沙門氏菌除可感染人外，還可感染很多動物。人畜感染后均可呈無癥狀帶菌狀態，也可表現為有臨床癥狀的致死性疾病，它可能加重病態或死亡率，或者降低動物的繁殖生產力，造成極大的經濟損失。因此，沙門氏菌在食品安全上具有非常重要的地位，受到普遍的重視。

目前，沙門氏菌檢測方法主要有培養法、實時熒光定量PCR(real-time?PCR)方法、環介導等溫擴增技術(Loop-mediated?isothermal?amplification，LAMP)方法和酶聯免疫吸附方法(Enzyme?Linked?Immunosorbent?Assay，ELISA)等。目前，沙門氏菌的國家標準檢測方法(GB4789.4-2010)是培養法，培養法采集樣品后，先增菌培養8-18h，再用不同的培養基進行增菌培養，再挑取可疑菌落進行生化鑒定或者運用全自動微生物生化鑒定系統進行鑒定；其缺點是：培養周期長，需要60h以上，費時費力，而且對于仍然具有致病性的“活的非可培養狀態”(Viable?But?Non-Culturable，VBNC)的細菌敏感性較低，可導致檢測結果呈假陰性，尤其是冷凍食品假陰性率非常高，造成極大的食品安全隱患。Real-time?PCR方法和全自動微生物生化鑒定系統所用試劑和儀器都較昂貴，而且對操作人員的要求較高，尤其對于大批量樣品的檢測成本非常高，常規實驗室難以接受；而且Real-time?PCR和LAMP方法可能因為樣品存在對酶活性具有抑制作用的物質而導致結果呈現假陰性；LAMP方法敏感性高，但非常容易造成氣溶膠污染，產生假陽性，造成檢測結果錯誤；ELISA免疫學方法操作復雜，費時費力且不便于標準化及高通量操作。

發明內容

鑒于上述各種方法的不足，本發明旨在克服現有技術的不足，提供一種檢測周期短、敏感性高、特異性強、操作簡單、成本低廉、可準確地檢測食品中沙門氏菌的試劑盒及方法，可在1d之內得到結果，同時無需昂貴的儀器和復雜的試劑，避免因為樣品存在DNA聚合酶的抑制因子而得到假陰性結果，可用于多種食品中沙門氏菌的檢測等。

本發明的技術解決方案是：

一種檢測食品中沙門氏菌的試劑盒，

該試劑盒包含：無菌去離子水，聚合酶鏈反應PCR反應預混液，對照品；

所述PCR反應預混液含有PCR反應緩沖液，MgCl2，脫氧核糖核苷三磷酸，檢測用引物，Taq?DNA聚合酶，DNA染料；

所述檢測用引物為如下4條引物的混合物：

salF：GGAACGAACTAATTCAGCGATA；

salR：AGATGTCATTAACCTTGTGGAG；

27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG；

1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT；

所述對照品分為陰性對照品和陽性對照品，陰性對照品為無菌去離子水，陽性對照品為salF/salR和27F/1492R兩對引物的擴增產物經凝膠電泳純化回收得到的DNA片段。

一種檢測食品中沙門氏菌的擴增內標PCR方法，其特征在于依次按照如下步驟進行：

(a)樣品的采集：無菌采集可疑食品；

(b)增菌培養：將采集的可疑食品混合均勻后無菌取樣25g，放入無菌研缽、組織研磨器內研磨碎或放入均質袋內均質2min，加入無菌的營養肉湯培養基225ml，37±1℃振蕩培養6-8h，得增菌液；

(c)DNA提取：取培養后的增菌液，振蕩混勻，取1.5ml于離心管中1000rpm離心1min，除去較大塊的食品碎片，取上清10000rpm離心10min，除去上清液，用無菌去離子水重懸、洗滌沉淀，10000rpm離心10min，棄上清，用少量無菌去離子水重懸沉淀，沸水浴5min，冰浴5min，1000rpm離心5min，取上清液，得樣品模板DNA；

(d)PCR反應管制備：PCR反應管的制備及PCR反應預混液的融化置于冰上進行；