[發(fā)明專利]用于蛋白質(zhì)順磁標(biāo)記的乙二胺四乙酸類探針的合成方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510010417.0
• 申請日: 2015-01-09
• 公開（公告）號: CN104610138A
• 公開（公告）日: 2015-05-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蘇循成;趙宇;楊茵;楊峰
• 申請（專利權(quán)）人: 南開大學(xué)
• 主分類號: C07D213/71
• 分類號: C07D213/71;C07K1/13;G01N24/10;G01N24/08
• 代理公司: 天津佳盟知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12002
• 代理人: 侯力

技術(shù)領(lǐng)域

?本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)順磁標(biāo)記領(lǐng)域，特別是一種用于蛋白質(zhì)順磁標(biāo)記的乙二胺四乙酸類探針的合成方法。

背景技術(shù)

近年來，高分辨順磁核磁共振在生物大分子等結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究中發(fā)揮的作用日益重要。此技術(shù)通過順磁中心的未配對電子與蛋白質(zhì)分子自旋核的相互作用來提供豐富的長程結(jié)構(gòu)限制信息，如順磁弛豫增強(qiáng)（paramagnetic?relaxation?enhancement，PRE）、贋接觸化學(xué)位移（pseudocontact?shifts，PCS）、殘余偶極耦合（residual?dipolar?couplings，RDC)，利用這些順磁信息，我們可以進(jìn)一步研究生物大分子的空間結(jié)構(gòu)、生物功能以及分子之間的相互作用（(a)?J.?Biomol.?NMR,?2010,?46:?101-112.?(b)?Annu?Rev?Biophys,2010,?39:?387-405.?(c)?Chem?Rev,?2009,?109(9):?4108-4139.?(d)?Prog?NMR?Spectr,2002,?40:?249-273）。

由于大多數(shù)蛋白質(zhì)沒有順磁中心，為獲得上述順磁信息就需要借助合適的雙功能順磁探針，并通過與蛋白質(zhì)定點(diǎn)連接來實(shí)現(xiàn)。連接后，由于順磁效應(yīng)，順磁中心附近氨基酸殘基的化學(xué)環(huán)境會(huì)發(fā)生較大的變化，導(dǎo)致核磁共振譜峰的化學(xué)位移亦發(fā)生明顯改變，進(jìn)而得到PCS、PRE或RDC等相關(guān)順磁數(shù)據(jù)。由此看來，雙功能順磁探針的設(shè)計(jì)與合成在蛋白質(zhì)順磁研究中尤為重要（Chinese?J?Magn?Reson,2014,?31(2),?155-171）。

通過有機(jī)化學(xué)手段合成的雙功能順磁探針通常由以下兩個(gè)不同的單元構(gòu)成：1）一個(gè)具有很強(qiáng)金屬離子螯合性能的基團(tuán)；2）一個(gè)可與蛋白質(zhì)定點(diǎn)連接的活性反應(yīng)基團(tuán)。前者可以螯合具有不同順磁物理特性的金屬離子（如鑭系金屬離子，過渡金屬離子），即順磁中心；后者與蛋白質(zhì)上唯一的活性氨基酸殘基（如半胱氨酸、非天然氨基酸）反應(yīng)，可達(dá)到對蛋白質(zhì)定點(diǎn)選擇性標(biāo)記的目的，從而進(jìn)一步用于蛋白質(zhì)順磁研究。

為獲得良好的順磁數(shù)據(jù)，在設(shè)計(jì)探針時(shí)，含有多氨基多羧基的螯合配體常被用作為理想順磁探針的基本骨架。從探針的骨架結(jié)構(gòu)出發(fā)，又可將其劃分為兩大類，一類以非環(huán)狀結(jié)構(gòu)的乙二胺四乙酸（EDTA）、二乙烯三胺五乙酸（DTPA）、2,6-吡啶二甲氨基-N,N,N′,N′-四乙酸（PyMTA）等衍生物為主，另一類以環(huán)狀結(jié)構(gòu)的1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7,10-四乙酸（DOTA）等衍生物為主，這些探針均可與順磁金屬離子配位形成熱力學(xué)穩(wěn)定的配合物。圖1中列出了已報(bào)道的部分代表性的順磁探針。

Gaponenko等人（J.?Biomol.?NMR,?2002,?24:?143–148）將已商業(yè)化的EDTA系列探針，即圖1中的化合物L(fēng)-1，通過活化巰基的方法定點(diǎn)標(biāo)記到目標(biāo)蛋白質(zhì)。其中，EDTA作為配位化學(xué)中應(yīng)用廣泛的有機(jī)螯合配體，可與金屬離子穩(wěn)定結(jié)合。他們使用此探針在滴加Co²⁺和Yb³⁺后，成功獲得了PCS和RDC數(shù)據(jù)，并得到溶液中對稱二聚體蛋白質(zhì)中每個(gè)單體的結(jié)構(gòu)信息。

Prudêncio等人（Chem.?Eur.?J.,?2004,?10:?3252–3260）報(bào)道了DTPA系列探針，即圖1的化合物L(fēng)-2，此類探針具有8個(gè)螯合位點(diǎn)且與順磁金屬離子形成非常穩(wěn)定的配合物。此外，它包含兩個(gè)活性巰基，由DTPA雙酸酐與S-(2-氨乙基)甲基硫代磺酸反應(yīng)得到，可以和目標(biāo)蛋白質(zhì)上距離8~10?的兩個(gè)半胱氨酸殘基同時(shí)反應(yīng)，生成兩個(gè)二硫鍵，從而增強(qiáng)了探針的剛性，限制了探針與蛋白質(zhì)間的相對運(yùn)動(dòng)，避免了PCS平均化，但兩個(gè)半胱氨酸殘基的位置需仔細(xì)斟酌，含有多個(gè)半胱氨酸的蛋白質(zhì)在表達(dá)和純化過程中也有可能二聚或沉淀。在與蛋白質(zhì)連接，滴加順磁金屬離子后，其NMR譜圖至少有5套信號峰，HSQC譜圖非常復(fù)雜，難于分析。故此探針常用于獲得PRE作為限制條件來研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。