[發明專利]試劑盒及其在核酸測序中的用途

有效

• 申請號: 201480081856.4
• 申請日: 2014-09-12
• 公開（公告）號: CN106715713B
• 公開（公告）日: 2020-11-03
• 發明（設計）人: 耿春雨;于競;祝珍珍;章文蔚;李計廣;龔梅花;蔣慧;賀玲瑜
• 申請（專利權）人: 深圳華大智造科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6806;C12Q1/6869
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 趙天月

1.一種基于雙鏈DNA制備環狀雙鏈DNA的方法，所述雙鏈DNA片段具有兩個平端末端，并且所述雙鏈DNA片段的四個末端核苷酸均不具有磷酸基團，其特征在于，所述方法包括：

使所述雙鏈DNA與第一分離的寡核苷酸相連，以便獲得第一連接產物；

對所述第一連接產物進行第一熱變性處理，以便獲得第一單鏈DNA分子；

利用第一引物與所述第一單鏈DNA分子互補配對發生鏈延伸反應，以便獲得鏈延伸反應產物，其中，所述鏈延伸反應產物含有一個尿嘧啶；

使所述鏈延伸反應產物與第二分離的寡核苷酸相連，以便獲得第二連接產物；

利用第二引物使所述第二連接產物發生引物介導的缺口平移和末端連接反應，以便獲得第三連接產物，其中，所述第三連接反應產物含有兩個尿嘧啶；

利用USER酶(Uracil-Specific Excision Reagent)對所述第三連接產物進行切割，以便獲得第一切割產物，所述第一切割產物含有兩個缺口；以及

使所述第一切割產物發生環化反應，以便獲得所述環狀雙鏈DNA，其中一條鏈有堿基缺失，任選地所述堿基缺失的長度為1nt，其中，

所述第一和第二分離的寡核苷酸分別包括：

第一鏈，所述第一鏈的5’末端核苷酸具有磷酸基團，并且所述第一鏈的3’末端核苷酸為雙脫氧核苷酸；以及

第二鏈，所述第二鏈的5’末端核苷酸不具有磷酸基團，并且所述第二鏈的3’末端核苷酸為雙脫氧核苷酸，

其中，

所述第一鏈的長度大于所述第二鏈的長度，并且所述第一鏈和所述第二鏈之間形成雙鏈結構，

所述第一引物特異性識別所述第一分離的寡核苷酸的第一鏈，并且所述第一引物中含有尿嘧啶，

所述第二引物特異性識別所述第二分離的寡核苷酸的第一鏈，并且所述第二引物中含有尿嘧啶。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一和第二分離的寡核苷酸分別包括一個III型內切酶的識別位點。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述III型內切酶為EcoP15 I。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一和第二分離的寡核苷酸的至少之一包括：

第一突出端，所述第一突出端位于所述第一鏈的3’端；以及

任選的第二突出端，所述第二突出端位于所述第二鏈的3’端。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，當存在第二分離的寡核苷酸時，所述第一突出端的長度大于所述第二突出端的長度。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述第一突出端的長度為10～35nt。

7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述第二突出端的長度為0～10nt。

8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一分離的寡核苷酸、第二分離的寡核苷酸、第一引物以及第二引物均為DNA。

9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一鏈的長度為20～50nt。

10.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二鏈的長度為10～15nt。