[發明專利]病毒疫苗及其制備方法

在審

• 申請號: 201480050520.1
• 申請日: 2014-09-08
• 公開（公告）號: CN105744952A
• 公開（公告）日: 2016-07-06
• 發明（設計）人: 克里什納·莫漢·瓦德雷夫;文卡特桑·拉馬沙米;普拉桑納·庫馬爾·杜夫魯
• 申請（專利權）人: 巴拉特生物技術國際有限公司
• 主分類號: A61K39/12
• 分類號: A61K39/12;C12N7/02;C12N7/04;C12N7/06
• 代理公司: 北京安信方達知識產權代理有限公司 11262
• 代理人: 王瑋瑋;鄭霞

發明領域

本發明涉及病毒疫苗組合物的領域。特別地，本發明涉及乙型腦炎疫苗組合物以及制備抵抗乙型腦炎感染的疫苗組合物的過程或方法。本發明涉及用于生產和純化病毒原液(virusbulk)的方法及其所述乙型腦炎病毒原液的滅活技術。

發明背景

乙型腦炎病毒(JEV)是蚊傳感染，是整個亞洲病毒性腦炎的主要原因，并越過其大陸界限進行傳播。JEV被歸類為黃病毒科(flavivirusfamily)和黃病毒屬(genusflavivirus)。它是包含10.9kb單鏈、反義RNA基因組的小包膜病毒(50nm)。病毒體RNA編碼包括四種結構蛋白和七種非結構蛋白的11種蛋白。在4種結構蛋白之中，表面包膜蛋白(E蛋白)作為細胞受體結合蛋白和融合蛋白，用于病毒附著并進入宿主中。所以抗體抵抗E蛋白中和病毒，并在保護中發揮重要作用。表面結構E蛋白是疫苗的重要組分，因此它對于用合適的疫苗效力穩定劑穩定該蛋白分子是非常重要的。

由于疫苗的廣大區域分布和環境溫度的差異，存在改進制備乙型腦炎病毒原液的生物過程用于制備生產用微生物并進一步利用疫苗的需求。乙型腦炎的生物過程包括在滾瓶燒瓶或細胞工廠單位中生長。通過滾瓶細胞培養或通過細胞工廠生產工業量的乙型腦炎疫苗需要較大量的時間，產量相對較少，并且還占用大量空間，這使得在每個細胞工廠中時常并經常難以控制和調節實驗參數。病毒原液的生產因此固有地缺乏操作的均一性。本發明通過其新的生物處理技術克服了這些困難，其中得到大量的工業乙型腦炎原液所需要的時間被大幅減少。與早期培養技術相比，使得疫苗原液能夠在少得多的時間內商業化生產。首先使Vero細胞在一次性生物反應器中生長，隨后是用JEV感染，其中，作為該發明的新穎的特征，完成了多次病毒收獲。產生病毒，接著是特別適用于乙型腦炎疫苗抗原的同時滅活和穩定化方法。乙型腦炎疫苗的穩定化通常需要在2℃-8℃的規定的溫度范圍保持疫苗小瓶或原液，穩定較長的時間段。這需要另外的基礎設施以運輸和貯存疫苗，從而增加了疫苗的成本。對于乙型腦炎，克服一些最實際的限制需要可選的穩定化技術。根據本發明中公開的方法從病毒原液如此獲得的疫苗不需要以上提及的任何特定冷藏設施并且在環境溫度條件即在室溫(25℃)是穩定的。通過本發明獲得的穩定性與在將乙型腦炎疫苗貯存在冷藏溫度(2℃-8℃)的情況中觀察到的穩定性是相當的。病毒原液和疫苗賦予受試者足夠免疫的效力和免疫原性也被保留。

發明目的：

本發明的一個目的是提供能夠預防乙型腦炎病毒的印度科拉爾(IndianKolar)毒株引起的乙型腦炎感染并對其提供治療的穩定的滅活的疫苗組合物。

本發明的另一個目的是提供使乙型腦炎病毒的科拉爾毒株在Vero細胞中適應的方法。

本發明的又另一個目的是提供以指定的實驗參數商業化生產純化的滅活的乙型腦炎原液的合適方法，以及能夠使用一次性生物反應器以高得多的產量多次收獲乙型腦炎原液的技術。

本發明的又一個目的是提供在乙型腦炎病毒原液的下游處理期間使用特定的基質柱的商業化規模的新穎純化技術。

本發明的又另一個目的是提供同時滅活和穩定所純化的乙型腦炎病毒原液的方法。

發明概述：

根據本發明的一個實施方案，公開了在一次性生物反應器中培養Vero細胞的多種方法。在包括適當的培養基組成和培養基所需的變化的多種實驗參數方面，Vero細胞的生長滿意水平被優化，以在期望量的時間內獲得滿意水平的細胞計數。用活的乙型腦炎病毒印度科拉爾毒株感染Vero細胞，并且相應地實施方案描述了在一次性生物反應器中使乙型腦炎病毒適應在Vero細胞中生長的方法。

根據本發明的另一個實施方案，乙型腦炎病毒的科拉爾毒株在Vero細胞中的適應從一次性生物反應器放大至下一后續規模的一次性生物反應器，以生成生產批次規模產量的純化的JEV原液。根據細胞容量，一次性生物反應器被命名為DB-1至DB-100至DB-500。

本發明的另外的實施方案提供了使用多種新穎的層析技術下游純化活JEV原液的可選方法，所述方法導致獲得高量的純化的JEV原液。

本發明的又一個實施方案公開了同時滅活和穩定純化的JEV原液的新穎方法。

本發明還提供了在25℃-37℃純化的滅活的JEV原液的穩定性的實驗數據，為疫苗配制做好準備。

本發明的又另外的實施方案提供了包含疫苗抗原的乙型腦炎疫苗組合物，其中所述抗原是乙型腦炎病毒的科拉爾毒株。

發明詳述：