[發(fā)明專利]芽孢桿菌種的生物質(zhì)和代謝物的生產(chǎn)方法及其用于生物害蟲防治的組合物

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201480034387.0
• 申請日: 2014-05-02
• 公開（公告）號: CN105357970A
• 公開（公告）日: 2016-02-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 伊莎貝爾·克里斯蒂娜·塞巴洛斯·羅哈斯;瓦勒斯卡·比列加斯·埃斯科瓦爾;桑德拉·莫斯克拉·洛佩茲;約翰·杰羅·米拉·卡斯蒂略;杰米·安德烈·古鐵雷斯·蒙薩爾韋;胡安·荷西·阿羅亞韋·托羅;路易莎·費(fèi)爾南達(dá)·波薩達(dá)·烏里韋
• 申請（專利權(quán)）人: 麥德林行政;金融和技術(shù)大學(xué);哥倫比亞奧古拉巴納尼羅斯協(xié)會
• 主分類號: A01N63/02
• 分類號: A01N63/02;C07K14/32
• 代理公司: 上海旭誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31220
• 代理人: 鄭立;劉萬磊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種增加包括枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)的芽孢桿菌種的生物質(zhì)和代謝物的生產(chǎn)的方法。該方法包括適宜的培養(yǎng)基和特定的環(huán)境條件，使得能夠生產(chǎn)大量的豐原素、表面活性肽和伊枯草菌素家族的生物質(zhì)和代謝物，其表現(xiàn)出對各種植物致病劑的抗真菌及抗細(xì)菌活性。

背景技術(shù)

在用于生物防治的微生物中，芽孢桿菌種屬的細(xì)菌受到廣泛關(guān)注，因?yàn)樗鼈兡墚a(chǎn)生多種多樣的抗生素化合物、保存期限長、培養(yǎng)時生長迅速、以及它們能夠在葉面大量繁殖[1,2,3,4]。尤其是，特定種類的芽孢桿菌例如枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)、蕈狀芽胞桿菌(Bacillusmycoides)、炭疽芽孢桿菌(Bacillusanthracis)及蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthurigiensis)顯示出抗微生物活性[4]。

這些細(xì)菌的抗微生物活性源于它們產(chǎn)生表面活性肽、伊枯草菌素和豐原素家族的脂肽的能力，這些脂肽的氨基酸序列及脂肪酸鏈的分支不同。表面活性肽表現(xiàn)出高的抗細(xì)菌活性，而伊枯草菌素和豐原素則因其抗真菌活性為人所知[4]。

現(xiàn)有技術(shù)描述了使用枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌在多種作物中控制各種致病微生物，上述作物包括水果和蔬菜作物例如黑莓、葡萄、覆盆子、草莓、西紅柿、黃瓜、黑胡椒、橙、哈密瓜、蘋果、桃、番荔枝、香蕉、木瓜、芒果和獼猴桃。

EP2311936公開了一種枯草芽孢桿菌菌株KS1(NITEBP-569)作為生物控制劑在藤木植物中抵抗幾種植物病原微生物。WO98/21968公開了枯草芽孢桿菌AQ153(ATCC55614)產(chǎn)生的一種抗生素，其能有效對抗細(xì)菌和真菌感染，并且也可以作為用于保護(hù)植物的方法，其包含這些抗生素化合物的應(yīng)用。

WO9850422和WO0029426公開了枯草芽孢桿菌菌株AQ713(NRRLB21661)及其突變體產(chǎn)生的其它抗生素化合物，其顯示出殺蟲、抗真菌和抗細(xì)菌活性。WO9909819公開了枯草芽孢桿菌菌株AQ713(NRRLNo.21665)的抗生素，其產(chǎn)生具有殺蟲活性的代謝物及一種高分子量的可溶于水的代謝物，其顯示出對抗玉米根蟲和其它線蟲的殺蟲及殺線蟲活性。

US2011/0318386描述了通過使用芽孢桿菌屬的生物控制劑誘導(dǎo)針對各種病原體的系統(tǒng)抗性，特別是分離的摩加夫芽孢桿菌(B.mojavensis)203-7和分離的蕈狀芽胞桿菌。接著ES2345969描述了一種用于香蕉和大蕉假莖(plantainpseudostems)的植物強(qiáng)化劑(phytostrengthener)，其包括枯草芽孢桿菌、綠色木霉菌(Trichodermaviride)和巨大芽孢桿菌解磷變種(B.megateriumvarphosphaticum)。

US2012/00031999公開了一種針對各種真菌病害，包括香蕉的黑葉斑病的控制策略，基于應(yīng)用合成的殺真菌劑和一些生物控制微生物及其代謝物(特別是枯草芽孢桿菌菌株QST713，對應(yīng)于商用產(chǎn)品的菌株)。

現(xiàn)有技術(shù)中公開的芽孢桿菌種的微生物的生產(chǎn)過程中，其生產(chǎn)的生物質(zhì)的量非常低，因?yàn)樗@得的細(xì)胞密度一般不大于5.0克/升[8,9]。因此，有必要開發(fā)新的方法以增加生物質(zhì)及其活性代謝物的產(chǎn)量。

類似的，有必要從這些微生物和/或其生物活性代謝物中開發(fā)出具有更高效力和選擇性的生物殺傷組合物，用于在各類作物上控制不同的植物致病劑。

附圖說明

圖1示出了枯草芽孢桿菌EA-CB0015生產(chǎn)的豐原素C的結(jié)構(gòu)。

圖2示出了枯草芽孢桿菌EA-CB0015在不同培養(yǎng)基中的細(xì)胞密度。

圖3示出了枯草芽孢桿菌EA-CB0015的化合物的HPLC色譜圖。

圖4示出了枯草芽孢桿菌EA-CB0015的P5純化的脂肽(m/z1429.9)的MS/MS圖譜。

圖5示出了枯草芽孢桿菌EA-CB0015的內(nèi)酯環(huán)經(jīng)堿水解后，P5純化的脂肽(m/z1447.8)的MS/MS圖譜。

圖6示出了枯草芽孢桿菌EA-CB0015在各種培養(yǎng)基中生產(chǎn)的脂肽的曲線下面積。

圖7示出了枯草芽孢桿菌EA-CB0015對各種植物病原性微生物產(chǎn)生的抑制百分比。

圖8示出了在不同培養(yǎng)基中獲得的枯草芽孢桿菌EA-CB0015CFS所產(chǎn)生的斐濟(jì)球腔菌(Mycosphaerellafijiensis)的生長抑制百分比。