[發明專利]通過原位雜交區分瞬時高危型HPV感染和持續高危型HPV感染

在審

• 申請號: 201480031040.0
• 申請日: 2014-03-28
• 公開（公告）號: CN105247077A
• 公開（公告）日: 2016-01-13
• 發明（設計）人: 馬小駿;王宏偉;吳興永;羅宇齡
• 申請（專利權）人: 領先細胞醫療診斷有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;G01N33/53
• 代理公司: 北京安信方達知識產權代理有限公司 11262
• 代理人: 鄭霞

本申請要求2013年3月28日申請的美國臨時申請序列號61/806,360的優先權的權益，該臨時申請的全部內容通過引用并入本文作為參考。

發明背景

本發明總的來講涉及原位雜交測定(insituhybridizationassays)和宮頸樣品分析，更準確地講涉及用于測試人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)感染的測定及宮頸組織樣品的分析。

高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)感染引起基本上所有宮頸癌和一部分頭頸部癌(ZurHausen,Virology384:260–265(2009))。然而，僅有HPV感染對于致癌性轉化是不夠的；80-90％的感染是瞬時的并且被免疫系統自我清除。目前的HPV檢驗方法如Hybrid2(DigeneCorporation；Gaithersburg,MD)和GP5+/6+PCR雖然具有極好的分析靈敏度但是無法將瞬時HPV感染與持續HPV感染區分開，而僅僅報告HPV陽性(Kroupis和Vourlidis,Clin.Chem.Lab.Med.49:1783-1799(2011))。結果，這些檢驗對于高級別上皮內瘤變(CIN2+)的臨床特異性差(40-50％)，從而對許多婦女造成不必要的隨訪程序(Kinney等人,Am.J.Clin.Pathol.134:193–199(2010))。因此，對于既有分析靈敏度又有臨床特異性的HPV測定法有未滿足的需求。

因此，基于HPV核酸的存在來準確地評價宮頸組織樣品并將其分類的方法存在需求。本發明滿足了這一需求并且也提供了相關優勢。

發明概述

本發明涉及將宮頸組織或細胞學樣品分類的方法，即通過使用反義E6或E7探針在宮頸組織樣品上進行原位雜交測定，其中反義E6或E7探針能同時檢測HPVDNA和HPVRNA；檢測HPV核酸的存在；和基于HPV核酸表達將宮頸組織樣品分類。

附圖簡述

圖1顯示培養的Caski細胞的福爾馬林固定石蠟包埋蠟塊(formalin-fixedparaffin-embeddedblock)的系列切片。Caski細胞對于編碼遍在蛋白(ubiquitin)的UBC(內源RNA對照)(左欄)、針對HPV16E6/E7mRNA的反義探針(中欄)和針對HPV16E6/E7DNA的有義探針(右欄)染色。上面一排，標準條件(無DNase)。下面一排，切片用DNase預處理后與HPV探針雜交。染色信號呈棕褐色(DAB)。細胞核用蘇木精染色(藍色)。

圖2顯示在正常宮頸和不同組織學級別的HPV相關宮頸病變中的HPVE6/E7染色圖案(patterns)。使用針對18種亞型(16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73和82)的一組探針，將宮頸活檢樣品對于高危型HPVE6/E7染色。正常宮頸對于高危型HPV呈完全陰性。注意到CIN1在宮頸上皮層的上1/3中具有強染色，但是其染色圖案與CIN3的不相同，在整個上皮，信號似乎為細棕褐色顆粒。一些CIN2表現出如圖所示的中間圖案。染色信號呈棕褐色(DAB)。細胞核用蘇木精染色(藍色)。

圖3顯示用靶向高危型HPV的反義探針或相應有義探針染色的CIN2病變。染色信號呈棕褐色(DAB)。細胞核用蘇木精染色(藍色)。

圖4顯示用靶向高危型HPV的反義探針或相應有義探針染色的CIN2病變。上面一排，20x透鏡；下面一排，40X透鏡。信號呈棕褐色(DAB)。細胞核用蘇木精染色(藍色)。

圖5顯示與圖3中用RNase消化預處理后用靶向高危型HPV的反義探針或相應有義探針染色的病變相同的CIN2病變。上面一排，20x透鏡；下面一排40X透鏡。信號呈棕褐色(DAB)。細胞核用蘇木精染色(藍色)。

圖6顯示與圖3中用DNase預處理后用有義HPV探針染色的病變相同的CIN2病變。左，20x透鏡；右，40X透鏡。信號呈棕褐色(DAB)。細胞核用蘇木精染色(藍色)。

圖7顯示宮頸上皮各層的示意圖。

發明詳述