[發明專利]肽聚糖的生物學測定

有效

• 申請號: 201480018300.0
• 申請日: 2014-03-25
• 公開（公告）號: CN105122059B
• 公開（公告）日: 2019-04-30
• 發明（設計）人: 皮埃爾·拉諾;馬克·比蓋特;羅塞利納·伯納德;法布里斯·阿蘭;馬蒂厄·卡龐捷;安納斯·丹伊斯;赫拉·海新納-伽爾比
• 申請（專利權）人: 羅蓋特兄弟公司
• 主分類號: G01N33/50
• 分類號: G01N33/50
• 代理公司: 中原信達知識產權代理有限責任公司 11219
• 代理人: 金海霞;楊青

本發明涉及一種用于測定樣品、特別是葡萄糖聚合物樣品中的肽聚糖(PGN)的生物學方法。該PGN測定包括：a)通過聲處理、加熱和/或堿性化處理該葡萄糖聚合物樣品；b)使處理后的樣品或其稀釋物與重組細胞接觸，該重組細胞表達外源TLR2(Toll樣受體2)和直接依賴與該TLR2相關的信號傳導路徑的報道基因。該報道基因編碼有色或熒光蛋白質或編碼其活性可用或不用底物來測量的蛋白質；c)測量該報道基因信號；和d)使用PGN的量與該報道基因信號強度之間的關聯性的標準曲線來確定該樣品中PGN的量。

發明領域

本發明涉及一種樣品、具體地葡萄糖聚合物樣品中的肽聚糖的測定。

發明背景

無菌性炎癥性發病是在使用用于治療性目的(例如：腹膜透析，腸外營養，通過靜脈途徑注射)的制品治療期間觀察到的主要并發癥。盡管這些炎癥性發病中的一些與化學性質問題相關(化學污染物的意外存在或某些化合物的不適當劑量)，但大多數病例是由于在制造工藝期間釋放的微生物來源的污染物的存在所致。現已明確確認，脂多糖(LPS)和肽聚糖(PGN)是主要污染物，在其以痕量水平存在于制品中時，其呈現觸發所述炎癥性發病的高風險。

許多質量控制實驗室以常規方式使用LAL(鱟(Limulus)阿米巴樣細胞溶解物)測定來檢測并測定LPS污染。這種測定是基于通過從鱟(Limulus))鱟(horseshoe crab))血淋巴提取的感測復合物對內毒素的識別。

目前提出同樣基于無脊椎動物血淋巴的提取物的反應性的其他測定用于檢測用于治療性應用的產品中的PGN(SLP-Wako，易默奈公司(Immunetics))。然而，這些測定具有并非極具特異性的缺點，因為其也與其他微生物來源的分子(例如β-葡聚糖)反應。此外，這些方法需要購買用于這個用途的特殊設備，一般會增加成本并因此限制這些測定技術的獲得。

此外，LPS和PGN具有根據其細菌來源可變的結構，從而導致炎癥反應性出現巨大差異。這就是為什么另外需要以標準分子的當量單位表達這些測定的結果的原因(例如，該LAL測定中大腸桿菌(E.coli)的LPS)。

此外，這些分子最常以大分子復合物形式存在，這會影響其溶解性以及其炎癥潛能。例如，PGN的大小高度可變并且經常與細胞壁中的其他分子(例如脂磷壁酸和脂肽)聚集。

因此，已研發出只考慮與這些分子相關的炎癥負荷的“生物學”方法。炎癥反應的效應細胞具有用于識別感染源特異性產生的分子結構的特定感測器。這些稱為PAMP(病原體相關分子模式分子)的分子基本上由TLR(Toll樣受體)和NLR(Nod樣受體)識別，所述受體的特異性與不同種類的炎癥分子的分子結構相關。與LPS(其為由TLR4型受體識別的配體)相反，PGN是由TLR2型受體識別的配體。

近年來，已研發出活體外細胞測定來替代炎癥反應的動物模型。這些測定大多是基于在被污染產品的存在下培育單核細胞以及基于炎癥性細胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、RANTES)的產生的反向滴定。然而，使用從血液分離的原代細胞的測定經受供體的顯著個體間差異性，此可導致實驗偏差。

與此相比，單核細胞細胞系給出恒定反應，這解釋了為什么其一般偏好原代細胞。然而，這些細胞系也并非完全令人滿意。例如，細胞因子的選擇經常被批評，因為大多數細胞因子是瞬時表達并且其在培養基中的濃度并非始終反映炎癥分子的真實負荷。由于所有這些單核細胞都表達大部分的TLR/NLR，所以基于其使用的測定對一種類型的污染物無選擇性，但將給出一個總體炎癥反應。

此外，由于這些細胞對不同炎癥分子的敏感性差異而產生嚴重問題。因此，TLR2配體PGN的反應性遠小于LPS，從而使得通過這些方法難以對其進行檢測。事實上，LPS在ng/mL級的濃度下誘導顯著反應，而獲得類似反應需要的PGN濃度要高100倍(w/w比率)。