[發(fā)明專利]一種豬促卵胞激素β-亞基的編碼基因FSHβ及其篩選方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410856926.0
• 申請日: 2014-12-31
• 公開（公告）號: CN104593377A
• 公開（公告）日: 2015-05-06
• 發(fā)明（設計）人: 李寧;李秋艷;王明;孫照霖;康倩倩
• 申請（專利權）人: 中國農業(yè)大學
• 主分類號: C12N15/16
• 分類號: C12N15/16;C12N15/10;C12N15/85;C12N5/10;C12N15/873;A01K67/027
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

技術領域

本發(fā)明涉及基因工程領域，具體的涉及一種豬促卵胞激素β-亞基的編碼基因FSHβ及其篩選方法。

背景技術

促卵泡激素，亦稱為卵泡刺激素(Follicle-Stimulating?Hormone，FSH)，因最早發(fā)現其對雌性動物卵泡成熟的刺激作用而得名。促卵泡激素是動物垂體前葉嗜堿性細胞合成和分泌的一種糖蛋白類促性腺激素，與促黃體激素、促甲狀腺激素、及胎盤產生的絨毛膜促性腺激素共同組成一個糖蛋白激素家族。它們的功能各異，結構卻極為相似，都是由α-亞基和β-亞基所組成。在同一物種內α-亞基是確定的，它們的α-亞基可以互換，而β-亞基不能互換，β-亞基具有激素各自的特異性，又具有種間特異性，是激素生物活性和免疫活性的決定因素。α-亞基和β-亞基單獨都不具有生物活性，只有當兩者結合在一起引起立體結構上的變化，才具有生物活性。一般認為，α-亞基負責信號傳導作用，β-亞基是功能亞基，參與受體結合。后經研究發(fā)現，α-亞基和β-亞基均參加受體結合和信號傳導作用。它對雌性動物卵泡生長發(fā)育尤其對竇狀卵泡發(fā)育成熟起著至關重要的作用。促卵泡激素可在絕經期女性的尿液中提取得到，也可以通過基因工程的方法重組表達得到。臨床主要用于對不孕癥患者的治療，用以刺激卵泡的發(fā)育成熟，同時也用于體外人工受精和體內人工受精的相關治療中。

太湖豬高產仔數的物質基礎是高的排卵率和良好的子宮容量。而在卵泡發(fā)育和排卵過程中，FSH和LH是兩種起直接作用的糖蛋白激素，其中FSH應用于超排的研究已證明高濃度的FSH可以促進更多的卵泡成熟，在LH協(xié)同作用下，實現超排。近年來，在鼠、羊、牛等許多動物中，對抑制素免疫所引起的排卵率的變化最終也歸因于FSH濃度的上升。研究發(fā)現首次發(fā)情周期內，太湖豬循環(huán)血液中FSH濃度顯著高于其它豬種。因此，FSH被當作控制太湖豬高排卵率的候選基因。陳杰等采用PCR-SSCP作為遺傳標記，對二花臉豬FSHβ-亞基基因位點和產仔數性狀的關系進行了研究，他們發(fā)現該標記位點與二花臉豬的產仔數性狀顯著相關，PCR-SSCP標記基因型的不同可以導致豬的產仔數有顯著差異。因此，可以推斷FSHβ基因座位是控制豬產仔數性狀的主效基因，或與主效基因存在緊密的遺傳連鎖。究竟是FSHβ亞基本身在起主導作用，還是與它相連鎖的另外一個基因在起作用，有待進一步的研究。

我國是世界第一養(yǎng)豬大國，無論從經濟方面考慮還是從環(huán)境方面考慮，在保證需求的同時，減少母豬的飼養(yǎng)量，提高母豬的繁殖性能，具有重要的理論和實踐意義。如何提高母豬繁殖能力一直是困擾畜牧工作者的一個難題。母豬的年生產力主要由產仔數、仔豬存活率及產仔間隔所決定。但繁殖性狀的遺傳力低、性狀表現晚、而且是限性遺傳，受環(huán)境因素影響很大，所以在過去，通過常規(guī)育種手段進行選育取得了一些進展，但進展緩慢，至今停滯不前，達到所謂的“選擇高原”。據報道，法國用30多年的時間來改良豬產仔數性狀，但進展甚微；丹麥將產仔數提高1頭用了50多年。

因此，有必要利用最新的分子生物學技術，從基因水平著手，獲得繁殖力高的轉基因豬。以后在豬中與生殖及其產仔數的功能研究和未來轉基因育種打下重要基礎。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于通過構建二花臉豬基因組BAC文庫，篩選獲得豬促卵胞激素β-亞基的編碼基因FSHβ，從而將該基因應用于轉基因克隆豬的構建提高母豬產仔數。

本發(fā)明提供了一種豬促卵胞激素β-亞基的編碼基因FSHβ，所述基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。

本發(fā)明提供了一種基因FSHβ的篩選方法，所述方法包括以下步驟：

(1)構建二花臉豬基因組BAC文庫：采二花臉公豬靜脈血制備核DNA，酶切后獲得核DNA片段；將所述核DNA片段與載體連接后點擊轉化感受態(tài)菌獲得二花臉豬基因組BAC文庫；

(2)從所述BAC文庫中篩選獲得包含SEQ?ID?NO:1所示的核苷酸序列的BAC克隆；

利用篩選引物對二花臉豬基因組BAC文庫超級池進行PCR擴增，篩選出陽性克隆作為BAC文庫二級池；再次利用所述篩選引物對BAC文庫二級池進行PCR擴增，篩選出含有SEQ?ID?NO:1所示的核苷酸序列的BAC克隆；

其中所述篩選引物為：