[發(fā)明專利]三陰乳腺癌標(biāo)志物COL4A2及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410837151.2
• 申請(qǐng)日: 2014-12-30
• 公開（公告）號(hào): CN104531710A
• 公開（公告）日: 2015-04-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 何勁松;陳偉財(cái);葉偉亮;孫婕;俞莉敏
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 何勁松
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/63;C12Q1/68;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 無(wú)
• 代理人: 無(wú)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和腫瘤藥物領(lǐng)域，具體涉及一種三陰乳腺癌標(biāo)志物COL4A2及其在三陰乳腺癌診斷中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

乳腺癌是女性中最常見且致死率最高的惡性腫瘤。全球每年有將近130萬(wàn)女性患上乳腺癌，并且有超過(guò)40萬(wàn)女性因?yàn)槿橄侔┑霓D(zhuǎn)移復(fù)發(fā)而死亡。不同類型的乳腺癌可具有顯著不同的生物學(xué)特性與臨床表現(xiàn)。因此，對(duì)患者的乳腺癌進(jìn)行分類已成為用于確定治療方案的重要組成部分。目前臨床上主要應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法，根據(jù)雌激素受體(estrogen?receptor，ER)、孕激素受體(progesterone?receptor，PR)和HER-2的檢測(cè)結(jié)果，將乳腺癌分為4種分子亞型：luminal?A型(ER陽(yáng)性或PR陽(yáng)性，HER-2陰性，Ki67低表達(dá))、luminal?B型(ER陽(yáng)性或PR陽(yáng)性，HER-2也陽(yáng)性)、HER-2過(guò)表達(dá)型(ER、PR陰性，HER-2陽(yáng)性，Ki67多為高表達(dá))和basal-like型(ER、PR、HER-2均陰性)。

乳腺癌中惡性程度最高的一種亞型，稱為三陰性乳腺癌，以雌激素受體(ER)陰性/黃體激素受體(PR)陰性/表皮生長(zhǎng)因子受體(HER2)陰性為特征，三陰乳腺癌中有80-90％屬于basal-like型。其發(fā)病率約占乳腺癌中的17％～25％，由于缺乏抗雌激素和抗HER2靶向治療的靶標(biāo)，以及極高的概率發(fā)生轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，是預(yù)后最差的一種乳腺癌類型。所以對(duì)三陰性乳腺癌需要盡早發(fā)現(xiàn)盡早治療，越早發(fā)現(xiàn)治愈率將大大提高。然而，目前對(duì)三陰乳腺癌標(biāo)志物的研究很少，本發(fā)明的目的在于發(fā)現(xiàn)新的三陰乳腺癌標(biāo)志物。

發(fā)明人通過(guò)對(duì)不同細(xì)胞系進(jìn)行比較研究，在三陰乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231中發(fā)現(xiàn)一個(gè)特異表達(dá)的基因COL4A2，發(fā)明人進(jìn)一步設(shè)計(jì)合成干擾COL4A2基因表達(dá)的序列并將其分別構(gòu)建到質(zhì)粒載體上，轉(zhuǎn)染細(xì)胞MDA-MB-231，成功獲得高效干擾COL4A2基因表達(dá)的序列。本發(fā)明提供的三陰乳腺癌標(biāo)志物基因及高效干擾標(biāo)志物基因的siRNA具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種三陰乳腺癌標(biāo)志物COL4A2基因，所述標(biāo)志物基因在三陰乳腺癌細(xì)胞系高表達(dá)。

發(fā)明從MDA-MB-231、MCF-7、BT-474、SK-BR-3這4個(gè)細(xì)胞系中檢測(cè)COL4A2基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)COL4A2基因的mRNA在三陰乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231中高表達(dá)，而其他三個(gè)乳腺癌細(xì)胞系相對(duì)表達(dá)較少。進(jìn)一步的Western?blot檢測(cè)結(jié)果也顯示COL4A2蛋白在MDA-MB-231細(xì)胞系中的表達(dá)明顯高于其他3個(gè)細(xì)胞系。

本發(fā)明的目的是提供高效干擾三陰乳腺癌細(xì)胞中COL4A2表達(dá)的siRNA。所述siRNA序列見SEQ?ID?NO?1-SEQ?ID?NO?6。優(yōu)選siRNA序列為SEQ?ID?NO?5或SEQ?ID?NO?6。

本發(fā)明的目的還包括提供一種高效干擾三陰乳腺癌細(xì)胞中COL4A2表達(dá)的干擾質(zhì)粒載體，所述質(zhì)粒載體包括上述siRNA。優(yōu)選將siRNA構(gòu)建到質(zhì)粒載體pGenesil-1上形成干擾質(zhì)粒載體。更優(yōu)選的，siRNA序列為SEQ?ID?NO?5或SEQ?ID?NO?6。

本發(fā)明的目的還在于提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包含上述的siRNA分子，或者包含上述干擾質(zhì)粒載體。優(yōu)選的，所述藥物組合物包含序列為SEQ?ID?NO?5的siRNA分子或者包含序列為SEQ?ID?NO?6的干擾質(zhì)粒載體。

發(fā)明人根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中COL4A2(Gene?ID：1284)基因序列設(shè)計(jì)了6條干擾序列及1條陰性對(duì)照序列，并將其分別以酶切連接的方式構(gòu)建到質(zhì)粒載體pGenesil-1上，將構(gòu)建好的質(zhì)粒載體分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞系MDA-MB-231，結(jié)果顯示有3條質(zhì)粒載體干擾效率都在60％以上，最高達(dá)69.61％，可以有效沉默COL4A2基因mRNA的表達(dá)。

本發(fā)明的目的是提供一種三陰乳腺癌檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括特異性引物、內(nèi)參引物、標(biāo)準(zhǔn)DNA模板、熒光定量PCR反應(yīng)液。所述特異性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列為SEQ?ID?NO?14，下游引物序列為SEQ?ID?NO?15。

進(jìn)一步，本發(fā)明的目的在于提供上述檢測(cè)試劑盒在制備三陰乳腺癌輔助診斷或者預(yù)后制劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的還在于提供三陰乳腺癌標(biāo)志物COL4A2基因在制備檢測(cè)三陰乳腺癌試劑或治療抗三陰乳腺癌藥物中的應(yīng)用。