[發(fā)明專利]鵝絨成分的實時熒光PCR檢測用的引物和探針

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410835824.0
• 申請日: 2014-12-29
• 公開（公告）號: CN104630345A
• 公開（公告）日: 2015-05-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王玫;任亮;孔平;楊春光;顏懷玉;肇慧君;李晶泉;張浩
• 申請（專利權(quán)）人: 中華人民共和國遼寧出入境檢驗檢疫局;寶生物工程（大連）有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 大連創(chuàng)達專利代理事務(wù)所(普通合伙) 21237
• 代理人: 溫宏梅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種利用核酸擴增技術(shù)進行動物源性成分快速檢測的方法，具體是一種鵝絨成分的實時熒光PCR檢測用的引物和探針序列。

背景技術(shù)

羽絨是長在鵝、鴨的腹部，成蘆花朵狀的絨毛，成片狀的叫羽毛。由于羽絨是一種動物性蛋白質(zhì)纖維，比棉花、羊毛、蠶絲保溫性高，且羽絨球狀纖維上密布千萬個三角形的細(xì)小氣孔，能隨氣溫變化而收縮膨.脹，產(chǎn)生調(diào)溫功能，可吸收人體散發(fā)流動的熱氣，隔絕外界冷空氣的入侵。因此，羽絨是優(yōu)良的填充料，歷來受到國內(nèi)外人們的歡迎。我國作為世界上最大的羽絨羽毛制品生產(chǎn)、出口和消費大國，羽絨及制品總量占據(jù)了國際市場70％以上的份額。在羽絨產(chǎn)業(yè)中，占極大部分的是鵝絨和鴨絨產(chǎn)業(yè)。鵝絨與鴨絨相比較而言，鵝絨絨朵大，中空度高，蓬松性好，回彈性優(yōu)，保暖性強。一般來講鵝絨在各項指標(biāo)上都優(yōu)于鴨絨，因而在市場上鵝絨比鴨絨更受歡迎，鵝絨毛的價格比鴨絨毛高l.6倍左右。由于鵝絨與鴨絨外觀形態(tài)十分相似，所以很難區(qū)分，使一些商家有機可乘，以鴨絨代替鵝絨或在鵝絨中混入鴨絨來牟取暴利。鵝絨鴨絨兩者都屬于蛋白質(zhì)纖維，對兩種羽絨纖維的化學(xué)成分進行分析，發(fā)現(xiàn)兩者的氨基酸種類與含量基本相同，所以用化學(xué)的方法很難分辨鴨絨和鵝絨。國內(nèi)對于羽絨種類分析主要是采用現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)GB/T?10288-2003《羽絨羽毛檢驗方法》及紡織行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)FZ/T?8000l-2002《水洗羽毛羽絨試驗方法》，國外羽絨種類分析常用標(biāo)準(zhǔn)有JIS?L?1903和EN?12131。這些標(biāo)準(zhǔn)對于羽絨結(jié)構(gòu)特征只進行了定性說明，難以有效指導(dǎo)鴨絨和鵝絨的種類鑒別。方法對檢驗人員要求高、主觀性大，容易產(chǎn)生誤判。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對鵝絨線粒體CYTB基因序列，設(shè)計一組特異性引物和探針，進而建立一種快速檢測鵝絨DNA方法，以克服傳統(tǒng)的顯微鏡法難以準(zhǔn)確判定的局限性，為鵝絨成分檢測提供有效工具，以期與傳統(tǒng)鑒別方法相結(jié)合，提高羽絨鑒別的客觀性和準(zhǔn)確度。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：

鵝絨成分的實時熒光PCR檢測用的引物和探針：

上游引物：5’-GCTACTAGCCATACACTAC-3’

下游引物：5’-GTTGGATTGTCTACTGAGA-3’

探針：5’-CGCAGACACTTCACTCGCCT-3’。

所述探針為TaqMan探針，其5’端標(biāo)記有報告熒光集團，3’端有淬滅熒光集團。

所述引物和探針應(yīng)用于鵝絨成分的PCR檢測，其體積比為：上游引物：下游引物：探針＝1：1：1；其檢測過程如下：

(1)待檢樣品DNA的提取

采用普通酚-氯仿抽提法或使用DNA提取試劑盒提取羊駝毛的DNA；

(2)鵝絨成分的實時熒光PCR擴增

A.在反應(yīng)管中加入Premix?Ex?Taq(2×)12.5μL，Primer?F(10μM)1μL，Primer?R(10μM)1μL，Probe(5μM)1μL，DNA*2μL，dH2O7.5μL，Total?25μL。

B.將PCR反應(yīng)管放入熒光定量PCR儀，按下述反應(yīng)條件完成PCR擴增：95℃30sec，1個循環(huán)，95℃5sec，60℃30sec，40個循環(huán)，PCR擴增。Negative?control反應(yīng)時，加入RNase?free?dH2O；Positive反應(yīng)時，做2個平行樣。

(3)應(yīng)用熒光定量PCR儀隨機軟件，分析擴增結(jié)果

反應(yīng)結(jié)束后，應(yīng)設(shè)置無效基線范圍?；€范圍選擇在3～15個循環(huán)，如果有強陽性樣本，應(yīng)根據(jù)實際情況調(diào)整基線范圍。閾值設(shè)置原則以基線剛好超過正常陰性對照擴增曲線的最高點，且Ct值＝40為準(zhǔn)，設(shè)置閾值后，分析樣品的檢測結(jié)果。

待測樣品鵝絨成分檢測Ct值大于或等于40，陰性對照、陽性對照和空白對照結(jié)果正常者，則可判定該樣品未檢出鵝絨成分。

待測樣品鵝絨成分檢測Ct值小于或等于36，陰性對照、陽性對照和空白對照結(jié)果正常者，則可判定該樣品檢出鵝絨成分。

待測樣品鵝絨成分檢測Ct值在36～40之間，應(yīng)重做實時熒光PCR擴增。再次擴增后的結(jié)果Ct值仍小于40者，且陰性對照、陽性對照和空白對照結(jié)果正常，則可判定該樣品檢出鵝絨成分；再次擴增后結(jié)果Ct值大于40，且陰性對照、陽性對照和空白對照結(jié)果正常，可判定該樣品未檢出鵝絨成分。

本發(fā)明采用實時熒光PCR技術(shù)，該技術(shù)特異性強、靈敏度高、操作簡便，特別適用于一些成分復(fù)雜的纖維制品中鵝絨成分的檢測。

附圖說明