[發明專利]用于檢測啤酒花矮化類病毒的NASBA擴增引物、試劑盒和檢測方法

有效

• 申請號: 201410832857.X
• 申請日: 2014-12-29
• 公開（公告）號: CN104450973A
• 公開（公告）日: 2015-03-25
• 發明（設計）人: 吳興海;張成標;魏曉棠;甘琴華;張京宣;邵秀玲;歷艷;尼秀媚
• 申請（專利權）人: 山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 褚慶森

技術領域：

本發明涉及一種用于檢測啤酒花矮化類病毒的NASBA擴增引物，試劑盒和檢測方法，屬于植物病原的檢測技術領域。

背景技術：

類病毒是迄今已知的引起植物病害的最小致病因子，為環狀RNA分子，其全長基因組由246～399個核苷酸組成，能引起許多經濟作物產生嚴重病害。根據其序列和結構的同源性、復制特性分為2個組，分別為馬鈴薯紡錘塊莖類病毒組(PSTVd)和鱷梨日斑類病毒組(ASBVd)。啤酒花矮化類病毒(?Hop?stunt?vroid)屬于馬鈴薯紡錘塊莖類病毒科啤酒花矮化類病毒屬，通常含307個左右核苷酸。1970年,?日本的Yamamoto?等人首次在矮化的啤酒花上發現了啤酒花矮化類病毒。1985年,日本的Sano首次在葡萄上發現了HSVd,?經過15年的研究,?認為HSVd的初侵染源為葡萄,?在進化過程中逐漸適應了新的寄主。目前國內外已報道的HSVd寄主包括黃瓜、葡萄、桃、李、扁桃、杏等草本及木本植物。中國已經在啤酒花、桃?、李、杏、葡萄、扁桃等植物上報道了HSVd。因此，規范啤酒花矮化類病毒的檢測鑒定方法一般操作規程，對于提高啤酒花矮化類病毒的檢疫檢驗效率、防止啤酒花矮化類病毒的傳入、傳出，保護我國農業的安全生產，促進我國農產品的順利出口，具有十分重要的意義。植物類病毒由于不顯性侵染比較普遍，癥狀表現受環境溫度的影響較大，而且幾種鑒別植物對不同類病毒的反應癥狀相似，故難于應用生物測定的方法。由于類病毒不能產生任何蛋白質，所以也不能使用檢測病毒的電鏡、血清學方法。因此，選用分子生物學方法對啤酒花矮化類病毒進行檢測。

NASBA（Nuleic?and?sequence?based?amplipicain,NASBA）即“核酸序列依賴性擴增”檢測技術是一種經典的恒溫擴增技術，適用于單鏈核糖核酸RNA一步擴增及檢測，已廣泛應用于人類及動植物病原的檢測與診斷。NASBA是由一對引物引導的,在含有T7?RNA聚合酶、RNAseH、反轉錄酶AMV、NTP、dNTP及需要使用的各種反應緩沖液所組成的標準反應體系中，通過連續均一的體外特異性酶促反應實現核苷酸序列的等溫擴增。

由于細胞壁中富含大量的多糖、酚類物質，植物病毒RNA的提取存在著穩定性差、重復性低、效率低等問題，加之在提取過程中RNA本身的自降解現象，病毒RNA的含量往往較低，對檢測方法的靈敏度和穩定性提出了較高要求。同時由于多糖等物質對于Taq聚合酶的抑制作用，限制了RT-PCR技術在葡萄、草莓、糧谷類等多酚含量較高的植物病毒RNA檢測中的應用。由于NASBA技術的反轉錄過程被直接合并到擴增反應中，因此NASBA具備了適合于病原RNA的擴增、檢測的特點，最適合各種RNA樣品的分析，符合植物病毒檢疫的要求，鑒于啤酒花矮化類病毒危害的嚴重性，加強環境中的的監控，提高檢測效率和確證的準確度，對有效控制啤酒花矮化類病毒的傳播,在現階段具有重要的實際意義。

發明內容：

本發明要解決的技術問題是提供一種用于檢測啤酒花矮化類病毒的NASBA擴增引物，同時提供一種檢測的試劑盒和檢測方法。其主要原理是利用一對引物引導，在含有T7?RNA聚合酶、RNAseH、反轉錄酶AMV、NTP、dNTP及需要使用的各種反應緩沖液所組成的標準反應體系中，通過連續均一的體外特異性酶促反應實現核苷酸序列的等溫擴增NASBA，經過循環反復，使RNA不斷擴增，對樣品中的啤酒花矮化類病毒進行準確的檢測。

本發明的實現，首先依據啤酒花矮化類病毒全基因組序列設計特異性引物，再提取待測樣品的核糖核酸（RNA），然后分別以特異性引物進行NASBA擴增，用瓊脂糖凝膠電泳對擴增產物進行檢測，最后根據NASBA擴增結果來判定樣品中是否含有啤酒花矮化類病毒。

本發明解決上述技術問題采用的技術方案如下：

本發明用于檢測啤酒花矮化類病毒的NASBA引物，其引物序列分別為?SEQ?ID?NO:1～2。

SEQ?ID?NO:1：NA-P1:5’-aattctaatacgactcactatagggagGAATCCAGCGAGAGGCGTG-3’。

SEQ?ID?NO:2：NA-P2:5’-aattctaatacgactcactatagggagAGTACCTCCCTGCCTTGTTTT-3’。

檢測啤酒花矮化類病毒的NASBA擴增試劑盒，包括如下組分：

（1）NASBA擴增反應液A的制備: