[發明專利]一種基于石墨烯氧化物芯片DNA解旋酶的檢測方法

有效

• 申請號: 201410832817.5
• 申請日: 2014-12-29
• 公開（公告）號: CN104611419A
• 公開（公告）日: 2015-05-13
• 發明（設計）人: 高力;時海霞;李琴;李嬈祺;周陽;陳克平;張春霞;連超群
• 申請（專利權）人: 江蘇大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/34
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物醫學領域中的蛋白質檢測，尤其一種基于生物芯片的DNA解旋酶檢測方法。

背景技術

DNA解旋酶是一種蛋白質，利用三磷酸腺苷（ATP）水解提供的能量打開互補的核酸雙鏈,?獲得單鏈，在DNA的復制、修復、重組以及轉錄等代謝過程都起著重要作用。它們常常依賴于單鏈的存在，并能識別復制叉的單鏈結構。一般在DNA復制過程中起到催化雙鏈DNA解旋的作用，這在病毒復制以及細胞繁殖需要單鏈DNA的反應中有著十分重要的作用，已被用于治療許多病毒性疾病，因此檢測DNA解旋酶的活性有著極其重要的意義。

目前存在的DNA解旋酶活性的檢測方法多數通過³²P的標記DNA鏈中的一條，通過凝膠電泳的方法來檢測，但這種方法成本較高、耗時、檢測的通量低。

2004年英國曼徹斯特大學的兩位科學家安德烈·海姆（Andre?Geim）和康斯坦丁·諾沃肖羅夫（Konstantin?Novoselov）首次制備出石墨烯，并獲2010年的諾貝爾物理學獎，受到了全世界研究人員的關注。石墨烯的氧化物制備簡單，成本比較低，表面有較多的功能基團，如醛基、羧基等，在石墨烯氧化物表面固定FAM（羧基熒光素）標記的雙鏈DNA時，當DNA由雙鏈變為單鏈時，FAM與石墨烯氧化物表面的距離發生改變，石墨烯氧化物通過熒光諧振能量傳遞(FRET)能淬滅FAM熒光的程度不同，基于這個特點，通過FAM熒光強度的變化對DNA解旋酶活性進行檢測。生物芯片是一種高通量的工具，利用石墨烯氧化物的特性，把生物芯片與石墨烯氧化物相結合，發展一種靈敏度較高的DNA解旋酶檢測方法。

發明內容

針對現有技術中存在不足，本發明提供了一種基于石墨烯氧化物芯片對DNA解旋酶的檢測方法，能低成本、高通量、高靈敏性對DNA解旋酶進行檢測。

本發明是通過以下技術手段實現上述技術目的的。

一種基于石墨烯芯片的DNA解旋酶的檢測方法，包括如下步驟：

（1）制備具有氧化石墨烯點陣的玻片：

1ml石墨烯氧化物溶液?(0.3?mg/ml)點在氨基修飾的玻片（長76mm，寬25mm，厚1mm）上，干燥后，用超純水沖洗，在具有石墨烯氧化物點陣的玻片上，加入1?ml?含有0.6?nM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDCI）?和6.0?nM?的N-羥基硫代琥珀酰亞胺（sulfo-NHS）的混合物后在室溫下12h。

（2）連接雙鏈DNA序列到具有石墨烯氧化物點陣的玻片：

一端氨基修飾另一端FAM標記的單鏈DNA序列，與互補的單鏈DNA按照1:1的比例混合后，放置在雜交盒中和步驟（1）制備的玻片進行化學反應12h，用PBS洗去多余的探針，掃描記錄玻片上DNA標記的FAM熒光強度F₁。

（3）DNA解旋酶檢測：

ATP為10?mM時，將不同數量的DNA解旋酶加入到步驟（2）處理過的玻片上，作用30min以下，PBS沖洗，掃描記錄玻片上DNA標記的FAM熒光強度F₂。

本發明的機理為：加入不同數量的DNA解旋酶在不同作用時間通過對步驟（2）中雙鏈DNA的作用，在DNA解旋酶作用前后發生變化，引起FAM的熒光強度發生改變，通過FAM熒光強度的變化前后的比較，PBS沖洗后掃描和分析，從而對溶液中是否存在DNA解旋酶進行檢測，當DNA解旋酶作用后FAM熒光強度F₂/DNA解旋酶作用前FAM熒光強度F₁比值接近于0時，說明溶液中存在DNA解旋酶。

本發明的有益效果是：

（1）本發明把石墨烯氧化物和微陣列芯片技術相結合,能低成本、高通量﹑高靈敏性對DNA解旋酶進行檢測。

（2）本發明充分運用生物芯片上互補雙鏈DNA與單鏈DNA上標記的FAM，與石墨烯氧化物表面的距離不同，DNA解旋酶對雙鏈DNA作用后，FMA與石墨烯氧化物的距離發生改變，引起FAM的熒光強度變化，根據這個原理對DNA解旋酶進行檢測，相對簡單而且有效。

附圖說明

圖1為本發明的流程示意圖。

具體實施方式

下面結合附圖以及具體實施例對本發明作進一步的說明，但本發明的保護范圍并不限于此。

（1）氨基修飾玻片的制備：在放有玻片的燒杯中加入5?ml過氧化氫（H₂O₂），然