[發(fā)明專利]用于檢測(cè)苯二氮卓類藥物的單克隆抗體及酶聯(lián)免疫方法與試劑盒

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410829641.8
• 申請(qǐng)日: 2014-12-26
• 公開（公告）號(hào): CN104530240A
• 公開（公告）日: 2015-04-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 袁宗輝;彭大鵬;王涓;潘源虎;王玉蓮;馮亮;劉振利
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K16/44
• 分類號(hào): C07K16/44;C12N5/20;G01N33/577;C12R1/91
• 代理公司: 武漢開元知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 42104
• 代理人: 徐紹新

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于藥物殘留分析和免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測(cè)苯二氮卓類藥物的單克隆抗體，本發(fā)明還涉及用于檢測(cè)苯二氮卓類藥物的酶聯(lián)免疫方法與試劑盒。

背景技術(shù)

苯二氮卓類(Benzodiazepines)是一類作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的鎮(zhèn)靜劑，能夠引起動(dòng)物鎮(zhèn)靜、嗜睡，或?qū)χ車沫h(huán)境冷漠等作用。藥物種類很多，多為1，4-苯并二氮卓的衍生物，其基本結(jié)構(gòu)是由兩個(gè)苯環(huán)和一個(gè)含有7個(gè)原子的雜環(huán)組成。通常用于將生產(chǎn)食品動(dòng)物運(yùn)往屠宰場(chǎng)過程中，以減少壓力，降低動(dòng)物的死亡率。此外，由于其使動(dòng)物嗜睡，起到間接促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的作用。因此在利益的驅(qū)使下大量或者不遵守休藥期的使用這類藥物會(huì)導(dǎo)致藥物殘留，人長(zhǎng)期攝入苯二氮卓類藥物，可產(chǎn)生依賴性或成癮性，突然停藥可產(chǎn)生停藥反應(yīng)，表現(xiàn)為抑郁，精神激動(dòng)，失眠等，由于這類藥物易通過胎盤屏障，會(huì)對(duì)嬰兒或幼畜會(huì)產(chǎn)生呼吸抑制作用。歐盟未制定此類藥物的最大殘留限量(MRL)，但禁止這類藥物用于所有食品動(dòng)物。英國(guó)也僅批準(zhǔn)用于伴侶動(dòng)物的治療。我國(guó)農(nóng)業(yè)部、衛(wèi)生部、國(guó)家藥品監(jiān)督管理局于2002年聯(lián)合發(fā)布的《禁止在飼料和動(dòng)物飲用水中使用的藥物品種目錄》中明確指出：嚴(yán)禁地西泮(安定)及其鹽、酯及制劑在動(dòng)物飼料和飲水中添加，允許治療劑量，禁止作為食品動(dòng)物的促生長(zhǎng)使用，在動(dòng)物性食品中不得檢出。

儀器分析方法的優(yōu)點(diǎn)在于靈敏、準(zhǔn)確、分離度高并且可進(jìn)行多殘留檢測(cè)的定性、定量研究，但需要昂貴的儀器、繁瑣的前處理、熟練的專業(yè)操作員。免疫分析方法克服了儀器分析方法的缺陷，尤其是ELISA方法操作簡(jiǎn)單、成本低、靈敏度高、只需要簡(jiǎn)單的儀器?，F(xiàn)有的ELISA方法的報(bào)道，大多為多克隆抗體的制備，變異性大、穩(wěn)定性差，或者單殘留檢測(cè)。所以，建立一種能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)苯二氮卓類藥物殘留的酶聯(lián)免疫方法很有必要。

CN101315374公開了一種地西泮殘留分析酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，以3-半琥珀酸酯地西泮為半抗原，與牛血清白蛋白偶聯(lián)得到免疫原，所制備的多克隆抗體僅能特異性識(shí)別地西泮。CN102565409?A公開了一種苯二氮卓類藥物的檢測(cè)試劑盒，采用購(gòu)自美國(guó)美迪生物技術(shù)有限公司的抗苯二氮卓單克隆抗體，該抗體能識(shí)別奧沙西泮、地西泮、阿普唑侖等多種苯二氮卓類藥物，但是不能識(shí)別去甲西泮、替馬西泮、艾司唑侖。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種能同時(shí)識(shí)別去甲西泮、替馬西泮、艾司唑侖等多個(gè)苯二氮卓類藥物的單克隆抗體。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是利用該單克隆抗體，制備一種檢測(cè)苯二氮卓類藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是利用該試劑盒，建立一種用于苯二氮卓類藥物非診斷目的檢測(cè)的酶聯(lián)免疫方法。

上述目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種能同時(shí)識(shí)別多個(gè)苯二氮卓類藥物的單克隆抗體，它是由雜交瘤細(xì)胞3D7所分泌的，所述雜交瘤細(xì)胞3D7保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC?NO:C201352。

所述的苯二氮卓類藥物，指的是地西泮、硝西泮、去甲西泮、替馬西泮、奧沙西泮、艾司唑侖、阿普唑侖。

進(jìn)一步，本發(fā)明提供了一種能同時(shí)檢測(cè)肉類產(chǎn)品中多個(gè)苯二氮卓類藥物殘留的酶聯(lián)免疫方法，該方法包括包被原、抗體的制備以及樣品前處理和檢測(cè)等步驟，具體如下：

(1)將半抗原7-氨基硝西泮通過碳二亞胺(EDC)法與卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)得到包被原；

(2)用保藏號(hào)為CCTCC?NO:201352的雜交瘤細(xì)胞3D7制備單克隆抗體；

(3)用步驟(1)的包被原包被固相載體；

(4)將待測(cè)樣品提取后進(jìn)行酶聯(lián)免疫檢測(cè)。

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述待測(cè)樣品的提取方法是：將待測(cè)樣品先用0.1M?NaOH提取，再加入乙酸乙酯離心，取乙酸乙酯層，氮?dú)獯蹈?，用PBS緩沖液復(fù)溶后加入正己烷去脂，取下清液。

本發(fā)明以上述單克隆抗體和包被原作為核心試劑與常規(guī)的其它試劑組合，制成了能檢測(cè)苯二氮卓類藥物的酶聯(lián)免疫檢劑盒，結(jié)合上述酶聯(lián)免疫方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)苯二氮卓類藥物的酶聯(lián)免疫檢測(cè)。

本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)是：

1.本發(fā)明以7-氨基硝西泮為半抗原，制備的單克隆抗體能夠識(shí)別地西泮、硝西泮、去甲西泮、替馬西泮、奧沙西泮、艾司唑侖、阿普唑侖，而現(xiàn)有技術(shù)無法同時(shí)識(shí)別以上苯二氮卓類藥物。