[發(fā)明專利]一種低分子肝素的純化方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410807934.6
• 申請(qǐng)日: 2015-08-03
• 公開（公告）號(hào): CN104497172A
• 公開（公告）日: 2015-07-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉乃山;宋立明;劉翠珍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 青島康原藥業(yè)有限公司
• 主分類號(hào): C08B37/10
• 分類號(hào): C08B37/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生化技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是所制得的低分子肝素再經(jīng)過以殼聚糖為載體,抗凝血酶Ⅲ為配基的親和色譜法來純化，最終得到了一種高純低分子肝素產(chǎn)品。

背景技術(shù)

肝素是一種天然的抗凝血物質(zhì)，但未分級(jí)的肝素存在許多局限性：半衰期短；需監(jiān)測(cè)凝血酶活性并調(diào)整用量；需持續(xù)靜脈點(diǎn)滴；受血小板Ⅳ因子影響，使療效不穩(wěn)定；導(dǎo)致骨質(zhì)疏松和血小板減少等。而低分子肝素與普通肝素比有很大區(qū)別，不但能產(chǎn)生良好且持久的抗血栓等作用，臨床安全性好，還具有抗炎、抗過敏、抗病毒、抗癌等功能，同時(shí)又可減輕或避免普通肝素的不良作用，從而使用起來更方便。

目前，低分子肝素在臨床上的應(yīng)用主要有靜脈血栓、冠狀動(dòng)脈綜合征、彌散性血管內(nèi)凝血、不穩(wěn)定性心絞痛和心肌梗死等，而且有相關(guān)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)表明其抗血栓作用較普通肝素強(qiáng)，也具有免疫調(diào)節(jié)作用，現(xiàn)已試用于艾滋病的臨床治療中。

本發(fā)明運(yùn)用以殼聚糖為載體,抗凝血酶Ⅲ為配基的親和色譜法對(duì)低分子肝素進(jìn)行純化，對(duì)其中的抗Xa活性成分進(jìn)行極大可能的篩選，使提純后的低分子肝素抗Xa活性為646.0IU/mg,比純化前提高6.3倍,而抗Ha活性極低，基本不體現(xiàn)，即生產(chǎn)出一種溶血栓能力較強(qiáng)，抗凝血能力較低的新型抗血栓肝素類藥物具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是生產(chǎn)純度較高的低分子肝素。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：將所制得的低分子肝素再經(jīng)過以殼聚糖為載體,抗凝血酶Ⅲ為配基的親和色譜法來純化，最終得到了一種高純低分子肝素產(chǎn)品。本發(fā)明具有工藝簡(jiǎn)單，操作安全，成本較低的特點(diǎn)，非常適用于規(guī)模化大生產(chǎn)。包括如下步驟：

（1）?制備親和樹脂:將殼聚糖在水中進(jìn)行懸浮溶脹24h，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH8.0-9.0，加入戊二醛溶液反應(yīng)2h，抽濾，再用水洗凈戊二醛至無味，在低溫條件下加入凝血酶，反應(yīng)5h，反應(yīng)終止后加入NaCl溶液洗去未偶聯(lián)的配基，并用水洗至pH為中性，用親和柱平衡液浸泡15min后，脫氣，再裝柱;

（2）將低分子肝素用pH為7.5Tris-HCl緩沖液溶解;

（3）?上樣至親和色譜柱;

（4）?上樣后用Tris-HCl緩沖液洗滌;

（5）用氯化鈉溶液洗脫;

（6）向洗脫液中加入3倍體積的乙醇低溫沉淀;

（7）真空干燥得到高純低分子肝素。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1

將所制得的低分子肝素再經(jīng)過以殼聚糖為載體,抗凝血酶Ⅲ為配基的親和色譜法來純化，最終得到了一種高純低分子肝素產(chǎn)品，包括如下步驟：

（1）制備親和樹脂

取100g殼聚糖在1000ml雙蒸水中進(jìn)行懸浮溶脹24h，用0.1mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH8.0-9.0，加入300ml?20%戊二醛溶液反應(yīng)2h，抽濾，再用雙蒸水洗凈戊二醛至無味，在低溫條件下加入1g凝血酶，反應(yīng)5h，反應(yīng)終止后加入3mol/LNaCl溶液洗去未偶聯(lián)的配基，并用雙蒸水洗至pH為中性，用親和柱平衡液浸泡15min后，脫氣，再裝柱。

（2）親和色譜純化

采用柱高40cm、內(nèi)徑1.0cm的分離柱，裝柱，取100mg低分子肝素用1.5ml?20mmol/LpH為7.5Tris-HCl緩沖液溶解，上樣至親和色譜柱中，上樣后用20mmol/LpH為7.5Tris-HCl緩沖液洗滌，再用3mol/L氯化鈉溶液洗脫，向洗脫液中加入3倍體積的乙醇，0℃低溫沉淀24h，過濾出沉淀物，并用少量純乙醇洗滌沉淀物，真空干燥后準(zhǔn)確稱量得到高純低分子肝素產(chǎn)物質(zhì)量。

實(shí)施例2

將所制得的低分子肝素再經(jīng)過以殼聚糖為載體,抗凝血酶Ⅲ為配基的親和色譜法來純化，最終得到了一種高純低分子肝素產(chǎn)品，包括如下步驟：

（1）制備親和樹脂

取100g殼聚糖在1000ml雙蒸水中進(jìn)行懸浮溶脹24h，用0.1mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH8.0-9.0，加入300ml?30%戊二醛溶液反應(yīng)2h，抽濾，再用雙蒸水洗凈戊二醛至無味，在低溫條件下加入1.5g凝血酶，反應(yīng)5h，反應(yīng)終止后加入3mol/LNaCl溶液洗去未偶聯(lián)的配基，并用雙蒸水洗至pH為中性，用親和柱平衡液浸泡15min后，脫氣，再裝柱。

（2）親和色譜純化