[發(fā)明專利]一種人類α防御素多肽酶聯(lián)免疫吸附試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410799730.2
• 申請日: 2014-12-19
• 公開（公告）號: CN104535771A
• 公開（公告）日: 2015-04-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 韓兵;王爍;馮玉冰;萬君花;劉俊
• 申請（專利權(quán)）人: 武漢市星熠艾克生物醫(yī)藥有限責任公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/577
• 代理公司: 北京輕創(chuàng)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11212
• 代理人: 楊立

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種人類α防御素多肽酶聯(lián)免疫吸附試劑盒、制備與檢測方法。

背景技術(shù)

防御素蛋白肽(Defensins)屬于抗菌肽家族，廣泛存在于包括植物、無脊椎動物和脊椎動物在內(nèi)的多種生物體。防御素蛋白肽均為分子量2-6kDa的陽離子小分子短肽，含保守的6個半胱氨酸殘基，形成3個典型的分子內(nèi)二硫鍵，分為α-防御素和13-防御素兩大類。α-防御素主要存在于人類嗜中性粒細胞的嗜天青顆粒中，亦被稱為人類嗜中性粒細胞肽(Human?neutrophol?peptides，HNP)。人類嗜中性粒細胞防御素主要有3種，即HNP1、HNP2和HNP3，具有促進中性粒細胞趨化、增強巨噬細胞吞噬功能、調(diào)節(jié)補體活性、刺激炎性因子的表達與釋放，以及趨化樹突狀細胞和T細胞等生物學作用，在機體的天然免疫應答和獲得性免疫應答中發(fā)揮非常重要的作用。大量研究表明，α防御素蛋白表達異常或功能受損與各種感染免疫性疾病(如重癥膿毒癥和炎癥性腸病等)的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，并且在敗血癥、肺炎、慢性阻塞性肺病等多種疾病的發(fā)病和調(diào)節(jié)中起了關(guān)鍵性的作用。臨床研究證明，α防御素(HNP)的水平與上述疾病的病情進展、嚴重程度及預后密切相關(guān)，可以發(fā)展為新的臨床診斷與病情監(jiān)測指標。

現(xiàn)在檢測HNP的方法主要有免疫組化法、免疫印跡(Western?blot)及酶聯(lián)免疫吸附測定方法(Enzyme-linked?immunosorbent?assay，ELISA)。各種方法相互驗證，同時又存在靈敏度、專業(yè)性、設(shè)施設(shè)備條件及成本的影響。目前，以血清學反應原理為基礎(chǔ)的ELISA方法是被廣泛接受和推廣的方法。與其他檢測方法相比，ELISA檢測方法具有成本低、檢測設(shè)備簡單、快速高效等優(yōu)點，并在不斷改進過程中，形成了競爭ELISA，非競爭ELISA，單抗體ELISA、微波ELISA以及雙抗體夾心ELISA方法。目前，市售的檢測HNP的雙抗夾心試劑盒，普遍存在檢測范圍窄、靈敏度低、價格昂貴等缺點。而制備該種試劑盒的關(guān)鍵，是得到良好的包被抗體和檢測抗體。包被抗體以及檢測抗體的靈敏度決定了雙抗夾心試劑盒的檢測范圍及靈敏度。

因此，研制高靈敏度的人類嗜中性粒細胞α防御素單克隆以及多克隆抗體，對于組裝一款靈敏度高、范圍寬、操作簡單便捷的人類嗜中性粒細胞α防御素多肽檢測試劑盒具有重要意義。

本發(fā)明使用天然防御素偶聯(lián)白蛋白來免疫，可得到比較優(yōu)異的兔多抗和鼠單抗，并組裝成試劑盒，靈敏度和精確度都有顯著提高。

發(fā)明內(nèi)容

鑒于現(xiàn)有技術(shù)所存在的檢測成本高、檢測范圍窄，靈敏度低等問題，本發(fā)明提供一種人類α防御素多肽酶聯(lián)免疫吸附試劑盒，所述檢測試劑盒使用了優(yōu)質(zhì)的多克隆抗體和單克隆抗體，具有檢測靈敏度高、檢測范圍寬、操作簡單便捷等優(yōu)點。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：

一種人類α防御素多肽酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(全稱為″人類嗜中性粒細胞α防御素多肽(HNP)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒”)，包括：酶標板、HNP蛋白凍干標準品、兔多克隆抗體、酶標二抗、標準品稀釋液、25倍濃洗滌緩沖液、抗體稀釋液、TMB顯色液、終止液；

所述酶標板為鼠抗人HNP單克隆抗體包被的酶標板，所述鼠抗人HNP單克隆抗體的包被濃度1μg/mL；

所述HNP蛋白凍干標準品從病人痰液中提取并純化凍干后獲得，使用前稀釋成不同濃度，10000pg/mL、4000pg/mL、1600pg/mL、640pg/mL、256、102、41pg/mL；所述稀釋時間為使用前15min；

所述兔多克隆抗體為兔抗人HNP多克隆抗體(初始濃度為0.2mg/mL，使用濃度為0.2μg/mL)；

所述酶標二抗為辣根過氧化物酶標記的羊抗兔免疫球蛋白多克隆抗體；

所述標準品稀釋液為20g/L?BSA、0.2g/L?KH₂PO₄、0.2g/L?KCl、2.9g/L?Na₂HPO₄·12H₂O、8g/L?NaCl水溶液；

所述樣品稀釋液為0.2g/L?KH₂PO₄、0.2g/L?KCl、2.9g/LNa₂HPO₄·12H₂O、8g/L?NaCl水溶液；