[發(fā)明專利]檢測(cè)人類CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性的探針及試劑盒

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410790374.8
• 申請(qǐng)日: 2014-12-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104404163A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-03-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曾慶;張中滿;張亞旭;張穎芬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州好芝生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廣州華進(jìn)聯(lián)合專利商標(biāo)代理有限公司 44224
• 代理人: 萬(wàn)志香;胡杰

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及用于一種用于檢測(cè)人類CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性的探針和試劑盒。

背景技術(shù)

華法林(Warfarin)屬香豆素類口服抗凝血藥，是用于治療血液栓塞性疾病(如心臟瓣膜置換術(shù)后、心房顫動(dòng)、靜脈血栓形成及肺梗塞等)的一線藥物。CYP2C9是華法林的主要代謝酶，其SNP的某些基因型會(huì)造成CYP2C9的酶活下降，以致華法林在體內(nèi)的清除減慢。華法林是通過(guò)抑制維生素環(huán)氧化物還原酶(VKOR)，使維生素K參與的凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ合成受阻，從而發(fā)揮抗凝作用，因此VKOR的一個(gè)重要亞單位基因(VKORC1)的SNP亦會(huì)造成個(gè)體對(duì)華法林的敏感性存在明顯差異。加之華法林的治療窗較窄，很少的劑量變化也可能導(dǎo)致血栓或出血，因此在臨床應(yīng)用上，相關(guān)基因的單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)可作為個(gè)性化治療的給藥依據(jù)。

目前，對(duì)基因多態(tài)性的檢測(cè)分析技術(shù)方法主要包括：ARMS熒光PCR法,基因測(cè)序、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法(RFLP)、基因芯片等方法。這些方法都有各自的優(yōu)點(diǎn)和缺陷，尚有待改進(jìn)和標(biāo)準(zhǔn)化。

1、ARMS熒光PCR法：擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)(Amplification?refractory?mutation?system，ARMS)利用PCR引物的3’端末位堿基必須與其模板DNA互補(bǔ)才能有效擴(kuò)增的原理，設(shè)計(jì)等位基因特異性PCR擴(kuò)增引物，在嚴(yán)格的條件下，只有在引物3’堿基與模板配對(duì)時(shí)才能出現(xiàn)PCR擴(kuò)增帶，從而檢測(cè)出基因突變。

2、直接測(cè)序：Sanger測(cè)序法因?yàn)榭梢宰x到DNA每個(gè)堿基的變化，目前被認(rèn)為是檢測(cè)基因突變的金標(biāo)準(zhǔn)方法。缺點(diǎn)是測(cè)序步驟繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，對(duì)設(shè)備和操作人員的要求較高，檢測(cè)周期長(zhǎng)，多限于在科研單位進(jìn)行，大多數(shù)醫(yī)院都無(wú)法獨(dú)立完成檢測(cè)，較難形成標(biāo)準(zhǔn)化操作、適合臨床單位應(yīng)用的體外診斷產(chǎn)品。

3.限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法(RFLP)：該方法成本低，對(duì)檢測(cè)設(shè)備要求低，突變基因的檢出限在5～10％。但是，勞動(dòng)強(qiáng)度稍大、需專業(yè)的技術(shù)人員、不適于高通量檢測(cè)和大規(guī)模臨床應(yīng)用。

4.基因芯片法：該方法是將探針固定于支持物上，如玻片或膜，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增出靶基因，再通過(guò)雜交手段進(jìn)行芯片雜交，應(yīng)用儀器進(jìn)行結(jié)果判讀。該方法可以進(jìn)行高密度基因檢測(cè)，但成本高、操作繁瑣、檢測(cè)流程相對(duì)較長(zhǎng)，在市場(chǎng)推廣上將受到一定限制。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種特異性高的檢測(cè)人類CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性試劑盒，該試劑盒既能實(shí)現(xiàn)CYP2C9基因*2(C430T)位點(diǎn)、*3(A1075C)位點(diǎn)和VKORC1基因(G-1639A)的基因型的單獨(dú)檢測(cè)，又能實(shí)現(xiàn)上述三個(gè)位點(diǎn)的并行檢測(cè)。

實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。

一種檢測(cè)人類CYP2C9和/或VKORC1基因多態(tài)性的試劑盒，包括有：針對(duì)CYP2C9基因C430T位點(diǎn)的擴(kuò)增引物和堿基組成如SEQ?ID?NO:3所示的熒光檢測(cè)探針、針對(duì)CYP2C9基因A1075C位點(diǎn)的擴(kuò)增引物和堿基組成如SEQ?ID?NO:6所示熒光檢測(cè)探針、和/或針對(duì)VKORC1基因G-1639A位點(diǎn)的擴(kuò)增引物和堿基組成如SEQ?ID?NO:9所示的熒光檢測(cè)探針。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述針對(duì)CYP2C9基因C430T位點(diǎn)的擴(kuò)增引物的堿基組成如SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2所示。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述針對(duì)CYP2C9基因A1075C位點(diǎn)的擴(kuò)增引物的堿基組成如SEQ?ID?NO:4和SEQ?ID?NO:5所示。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述針對(duì)VKORC1基因擴(kuò)增引物的堿基組成如SEQ?ID?NO:7和SEQ?ID?NO:8所示。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，還包括有UNG酶。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，檢測(cè)人類CYP2C9和/或VKORC1基因多態(tài)性的試劑盒，包括有針對(duì)CYP2C9基因C430T位點(diǎn)的擴(kuò)增引物SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2以及堿基組成如SEQ?ID?NO:3所示的熒光檢測(cè)探針、針對(duì)CYP2C9基因A1075C位點(diǎn)的擴(kuò)增引物SEQ?ID?NO:4和SEQ?ID?NO:5以及堿基組成如SEQ?ID?NO:6所示熒光檢測(cè)探針、和針對(duì)VKORC1基因G-1639A位點(diǎn)的擴(kuò)增引物SEQ?ID?NO:7和SEQ?ID?NO:8以及堿基組成如SEQ?ID?NO:9所示的熒光檢測(cè)探針。