[發(fā)明專利]一種酯酶基因estZ及其編碼的蛋白質(zhì)和應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410774237.5
• 申請日: 2014-12-16
• 公開（公告）號: CN104694558A
• 公開（公告）日: 2015-06-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張煉輝;陳少華;胡美英;常長青;鄧音樂
• 申請（專利權(quán)）人: 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N9/18;C12N15/70;C12N1/21;A62D3/02;A01H5/00;B09C1/10;C02F3/00;C12R1/19;A62D101/04;A62D101/28
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 林麗明

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及應(yīng)用環(huán)境微生物和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種酯酶基因estZ及其編碼的蛋白質(zhì)和應(yīng)用。具體用于農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留的去除，生產(chǎn)無公害綠色農(nóng)產(chǎn)品；同時可用于修復(fù)農(nóng)藥污染的土壤、水體等自然環(huán)境。

背景技術(shù)

農(nóng)藥的發(fā)明和使用為人類的生存和發(fā)展做出了巨大的貢獻(xiàn)，特別是在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、農(nóng)作物病蟲害防治、雜草清除等方面發(fā)揮了巨大的作用，成為保障農(nóng)業(yè)豐收高產(chǎn)，解決人類糧食問題不可或缺的重要條件之一。據(jù)統(tǒng)計，每年我國通過農(nóng)藥防治，糧食挽回約5845萬噸、棉花101.5萬噸、油料228.5萬噸，每年挽回直接經(jīng)濟(jì)損失約800億元。農(nóng)藥的使用量穩(wěn)步增長，已經(jīng)是提高農(nóng)民收入、促進(jìn)農(nóng)村消費、保障國民經(jīng)濟(jì)穩(wěn)定發(fā)展的必然選擇。但是，農(nóng)藥的使用也是一把雙刃劍，由于農(nóng)藥的不科學(xué)使用特別是超劑量和超范圍使用致使農(nóng)藥殘留問題日益突出，引起了一系列的食品安全問題和環(huán)境安全問題。一方面農(nóng)藥殘留污染直接導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥超標(biāo)，產(chǎn)品品質(zhì)下降，嚴(yán)重威脅到人們的生命安全和我國農(nóng)副產(chǎn)品的銷售。據(jù)統(tǒng)計，我國每年遭受殘留農(nóng)藥污染的作物面積超過10億畝。另一方面，環(huán)境中殘留農(nóng)藥通過食物鏈富集最終進(jìn)入人體內(nèi)，直接威脅到人類的生命健康；此外，人類所施用到田間的農(nóng)藥被植物體所截留的不足20%，有80%以上進(jìn)入環(huán)境中，不僅被植物體所截留的部分會產(chǎn)生殘留毒性，而且進(jìn)入環(huán)境中的部分也會通過食物鏈達(dá)到生物富集，進(jìn)而產(chǎn)生殘留毒性，給生態(tài)系統(tǒng)造成巨大的破壞。因此，消除環(huán)境及農(nóng)產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留污染已成為科研工作者亟待解決的具有重大經(jīng)濟(jì)和社會意義的科研命題。

生物降解技術(shù)(Biodegradation)可用于去除環(huán)境及農(nóng)產(chǎn)品中各類有機(jī)污染物，與傳統(tǒng)化學(xué)、物理處理方法相比具有操作簡便、經(jīng)濟(jì)實用、無二次污染等優(yōu)點。因此，研究利用微生物降解菌劑或酶制劑產(chǎn)品治理農(nóng)藥殘留污染已成為近年來研究的熱點。目前許多發(fā)達(dá)國家和大公司企業(yè)都投入巨資以從事農(nóng)藥殘留生物降解制劑的研究和開發(fā)，如美國?BCI?公司、美國工程服務(wù)生物修復(fù)公司已經(jīng)將降解制劑產(chǎn)品規(guī)模化生產(chǎn)，國內(nèi)的北京佳農(nóng)新貿(mào)易發(fā)展有限公司已成功生產(chǎn)“比亞”降解酶制劑可用于去除有機(jī)磷類農(nóng)藥殘留。但是，目前還沒有同時針對擬除蟲菊酯類和甲氧基丙烯酸酯類農(nóng)藥殘留的生物降解制劑產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種新的降解農(nóng)藥的酯酶基因estZ，該基因可用于農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留的去除，生產(chǎn)無公害綠色農(nóng)產(chǎn)品；同時可用于修復(fù)農(nóng)藥污染的土壤、水體等自然環(huán)境。

本發(fā)明的另一目的是提供該基因編碼的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明又一目的是提供該基因及其編碼的蛋白質(zhì)的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)：

一種能降解含酯鍵農(nóng)藥的酯酶基因estZ，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

本發(fā)明所述酯酶基因estZ是從一株能夠降解含酯鍵農(nóng)藥的銅綠假單胞菌(Pseudomonas?aeruginosa)菌株P(guān)AO1中克隆得到。所述菌株已于2014年12月5日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），保藏號是CCTCC?M?2014630。發(fā)明人通過質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)：菌株P(guān)AO1可以使高效氯氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯、甲氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、醚菌酯、吡唑醚菌酯和嘧菌酯等含有酯鍵的農(nóng)藥的酯鍵發(fā)生斷裂，使其失去農(nóng)藥毒性。

從菌株中克隆酯酶基因estZ?的具體方法為轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法。菌株P(guān)AO1能在基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板上利用高效氯氰菊酯等農(nóng)藥為唯一碳源生長，通過雙親株雜交使供體大腸桿菌S17-1中的pBT20質(zhì)粒上的轉(zhuǎn)座子mariner?隨機(jī)插入PAO1基因組后，利用轉(zhuǎn)座子上的慶大霉素抗性基因和降解過程中產(chǎn)生水解圈與否篩選突變株，并利用Tail-PCR?技術(shù)克隆出被插入失活的基因片段，然后再進(jìn)行功能驗證。

用上面的策略篩選到一株不能在基礎(chǔ)培養(yǎng)基加農(nóng)藥的平板上產(chǎn)生水解圈的突變株，進(jìn)一步的降解實驗表明該突變子不能降解高效氯氰菊酯等農(nóng)藥。設(shè)計引物，進(jìn)行Tail-PCR，多次PCR測序后，拼接結(jié)果表明插入位點為PA3734基因中間，該基因是功能未知的酯酶基因，全長為1206bp（編碼401個氨基酸），命名為estZ。這是一種新的降解農(nóng)藥的酯酶基因。

一種能降解含酯鍵農(nóng)藥的酯酶EstZ，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。