[發明專利]一種快速構建單細胞DNA測序文庫的方法和試劑盒

有效

• 申請號: 201410773064.5
• 申請日: 2014-12-15
• 公開（公告）號: CN104963000B
• 公開（公告）日: 2021-04-06
• 發明（設計）人: 石燕濱;吳凱;王文璐;張建光
• 申請（專利權）人: 杭州貝瑞和康基因診斷技術有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C12N15/11
• 代理公司: 北京市金杜律師事務所 11256
• 代理人: 孟凡宏;謝燕軍

本發明涉及用于構建單細胞DNA測序文庫的方法和試劑盒，更具體的，本發明涉及用于構建高通量測序的單細胞DNA測序文庫的方法和試劑盒。

技術領域

本發明涉及用于構建單細胞DNA測序文庫的方法和試劑盒，更具體的，本發明涉及用于構建高通量測序的單細胞DNA測序文庫的方法和試劑盒。

背景技術

隨著人類基因組計劃的完成，Sanger測序已進入廣大科研人員的研究中。但是科技的不斷革新使得這種雙脫氧核苷酸終止的測序模式愈發不能滿足測序的需求，于是新的高通量測序(也稱第二代測序)模式應運而生。這種測序技術使得測序費用更低，測序通量更高，測序時間更短。高通量測序技術的核心思想是邊合成邊測序，即通過捕捉新合成的末端的標記來確定DNA的序列。現有的技術平臺主要包括Roche/454 FLX、IllUmina/Hiseq、Miseq、NextSeq和Life Technologies/SOLID system、PGM、Proton等。到目前為止，HiSeq2000每個run可以達到6個人基因組30X覆蓋的測序通量，約600G/run數據，在測序時間上Hiseq2500可以達到平均每8分鐘讀取一個堿基的速度。而且隨著第二代測序技術的成熟，將其應用于臨床的研究迅猛發展。

隨著測序技術的發展，測序成本的降低，基因組測序技術已成為一種常規技術。以往的基因組測序或者轉錄組測序都是基于多細胞的水平進行的，然而這種的測序模式忽略了細胞間的異質性，以及忽略了細胞間異質性所導致的基因表達、細胞行為、藥物反應的差異。近期針對腫瘤發病人群中循環腫瘤細胞的研究也成為一熱點。腫瘤圖譜的繪制，對于研究腫瘤的進化，包括腫瘤的轉移不同發病時間段腫瘤的特異性，以及腫瘤擴散都有極為關鍵的意義。此外，單細胞研究在早期胚胎發育過程尤其是植入前胚胎的篩選有非常大的臨床指導意義。基于單細胞在臨床研究中的迫切性，對單細胞基因組的測序也愈發重要。

目前針對單細胞DNA測序文庫構建主要是通過全基因組擴增(Whole GenomeAmplification，WGA)的方式使得基因組DNA大量復制，復制后的基因組DNA能夠達到微克級量，足量的經過擴增后的基因組DNA再通過文庫制備流程進行基因組DNA文庫制備。目前市場上關于WGA擴增方式主要有兩種：第一種為鏈置換方式，該擴增方式主要是采用phi29酶恒溫擴增，從而實現對基因組DNA的鏈置換方式的擴增；第二種為通過聚合酶作用實現的兩部擴增法，該擴增方式通過兩次PCR實現對基因組DNA的擴增。擴增后的基因組DNA可以通過多種方式來構建測序文庫(見圖1)。比較經典的有兩種方式：第一種為比較基礎的基因組DNA文庫制備方法，此方法中基因組DNA經過超聲或者酶切打斷，打斷后的DNA進行末端修復，加A，加接頭，最后通過PCR得到所需的上機測序文庫；第二種是通過轉座酶的方式將基因組DNA打斷的同時加入接頭，最后通過PCR得到所需的上機測序文庫。目前市場所推出的針對單細胞測序文庫構建的試劑盒也是基于以上方案設計，首先單細胞基因組DNA經過WGA擴增的過程，擴增后的基因組DNA再進行常規的測序文庫構建。以上所述單細胞DNA測序文庫構建方法和試劑盒主要存在兩方面的缺陷：首先，從WGA到建庫的流程復雜，所需時間也較長，至少兩天的時間才能完成整個流程，不適合大規模的生產應用；其次，WGA擴增所引入的PCR堿基偏好性較大，從而導致整個基因組的覆蓋度和均一性較差。因此，迫切需要一種新的方法和試劑盒來改善目前單細胞DNA測序文庫構建的結果。

發明內容

鑒于目前單細胞DNA測序文庫構建過程中所遇到的問題，本發明人發現了新的更加簡化、更加快速、更加均一的單細胞DNA測序文庫的構建方法，其可適用于多種第二代測序平臺，包括但不限于如Roche/454 FLX、Illumina/Hiseq、Miseq和Life Technologies/SOLID system、PGM、Proton等測序平臺。