[發(fā)明專利]一種檢測SLC26A4基因突變的試劑盒及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410758386.2
• 申請日: 2014-12-10
• 公開（公告）號: CN104531850A
• 公開（公告）日: 2015-04-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 黃茜;及思瑩;楊君;何犇;易翔
• 申請（專利權(quán)）人: 中生北控生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及用于檢測耳聾相關(guān)基因SLC26A4IVS7-2A>G突變的試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

溶質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白家族26,成員4(solute?carrier?family?26,member?4；SLC26A4)基因定位于7q31，編碼離子轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白，對SO₄^2-，HCO^3-，I^-，Cl^-等多種單價或二價離子進行轉(zhuǎn)運，在機體離子成分平衡的維持中發(fā)揮重要作用。內(nèi)耳具有復雜而精細的液體平衡系統(tǒng)，因此任何致病性的基因突變都會導致內(nèi)耳離子成分和滲透壓的改變，從而對人的聽覺和身體平衡產(chǎn)生重要影響。SLC26A4純合或雜合突變是大前庭水管綜合征明確的致病原因。

該基因突變在中國聾啞人群中的發(fā)病率約8-12％。該基因可以有數(shù)以百計的突變形式，但中國聾啞人群中常見致病突變?yōu)镾LC26A4基因IVS7-2A＞G，該突變篩查為純合突變或復合雜合突變者時，意為發(fā)現(xiàn)了患兒耳聾的遺傳致病因素，可以通過預防感冒，避免顱腦外傷、劇烈運動等防止聽力波動和防止聾啞的發(fā)生，并進行定期檢測，對發(fā)現(xiàn)聽力下降者給與早期干預和治療。

目前針對單核苷酸多態(tài)性(Single-nucleotide?polymorphism，SNP)基因突變檢測的方法有數(shù)十種，如基因芯片法、熒光定量PCR法、限制性酶切片段長度多態(tài)性(RFLP)法和金標準PCR產(chǎn)物直接測序法等，但這些方法普遍存在技術(shù)要求高、儀器設(shè)備要求高、成本高等特點，因此在基層使用具有一定局限性。迫切需要一種簡便、快速檢測SLC26A4IVS7-2A>G突變的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種檢測SLC26A4基因突變的試劑盒及其應(yīng)用。

四引物擴增受阻突變體系PCR法(Tetras-primer?amplification?refractory?mutationsystem-PCR，四引物ARMS-PCR)其基本原理是：針對一個SNP位點設(shè)計2個延伸方向相反的內(nèi)側(cè)引物(Inner?primer)，2個引物的3’末端堿基分別與SNP位點的1個堿基相同(或互補)，并引入錯配堿基增加引物的特異性，然后按正常的方法設(shè)計2個方向相反的外引物(Outer?primer)；用這4個引物鏈組成的3對引物在1個PCR反應(yīng)中進行擴增(巢式PCR)；擴增產(chǎn)物用凝膠電泳檢測，出現(xiàn)2條帶的是純合型，出現(xiàn)3條帶的是雜合型。

本發(fā)明根據(jù)四引物擴增受阻突變體系PCR技術(shù)原理，針對SLC26A4基因IVS7(-2)位點A>G突變設(shè)計出一組特異引物，正常外引物序列如SEQ?ID?NO.1所示，突變外引物序列如SEQ?ID?NO.2所示，正常內(nèi)引物序列如SEQ?ID?NO.3所示，突變內(nèi)引物序列如SEQ?ID?NO.4所示。

本發(fā)明提供用于檢測的引物組合，其特征在于，包括以下四條引物：

正常外引物S-1：5‘-CATATGAGAATTGATTGTGTGTGTGTGC-3’(SEQ?ID?NO.1)

突變外引物S-2：5‘-TGTTTCTTCCAGATCACACACAAATAGG-3’(SEQ?ID?NO.2)

正常內(nèi)引物S-3：5‘-ATGAAATGGCAGTAGCAATTATCGGCT-3’(SEQ?ID?NO.3)

突變內(nèi)引物S-4：5‘-GGAGTTTTTAACATCTTTTGTTTTATTCCG-3’(SEQ?ID?NO.4)。

本發(fā)明提供了上述引物組合在檢測SLC26A4基因突變中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了上述引物組合在制備SLC26A4基因突變檢測試劑盒中的應(yīng)用。

含有上述引物組合的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護范圍。

可以將本發(fā)明引物以及相關(guān)試劑組裝成試劑盒，以方便使用。因此含有上述引物組合的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明的試劑盒可以是由多個隔斷所形成，以容納固定一個或多個如管或小瓶的容器。這些容器之一或者多個可以裝有本發(fā)明的引物，根據(jù)需要該引物可以是凍干形式或溶于緩沖液中的狀態(tài)。另外，本發(fā)明的試劑盒中還可以包括用于PCR反應(yīng)的一種或多種酶/試劑，以及實施本發(fā)明所需要的其它成分及用具。

進一步地，本發(fā)明試劑盒的工作程序為，當總體系為20μL時，如下：