[發明專利]一種人白細胞介素-29的重組變異體及其制備方法

在審

• 申請號: 201410756203.3
• 申請日: 2014-12-12
• 公開（公告）號: CN104402988A
• 公開（公告）日: 2015-03-11
• 發明（設計）人: 陳偉;陸源;李利云;鄔敏辰;吳靜
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C07K14/54
• 分類號: C07K14/54;C12N15/24;C12N15/81;C12N1/19;C12P21/02;C12R1/84
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技術領域

本發明提供了一種人白細胞介素-29成熟肽第33位賴氨酸定點突變為精氨酸的重組變異體(rhIL-29L)及其制備方法，屬于生物工程領域。

背景技術

人白細胞介素-29(interleukin?29，IL-29)是近年發現的一種新的細胞因子，其結構和功能與I型干擾素(interferon，IFN)相似，因此又稱為IFN-λ1。

人IL-29基因定位于19號染色體長臂(19q13.13)，包含5個外顯子，其基因結構與IL-10家族成員的基因結構相似，但與I型干擾素的基因結構(只含一個外顯子)有明顯差異。IL-29由含19個氨基酸的信號肽和181個氨基酸的成熟肽組成，其mRNA全長856bp，開放讀碼框為603bp。IL-29的相對分子質量約為20000～33000，有一個潛在的N-連接糖基化位點，有兩個二硫鍵。二硫鍵對IL-29的正確折疊和生物學活性十分重要。

人IL-29通過與細胞膜上的受體復合物結合，起始信號的轉導和發揮生物學作用。IL-29和IL-28共用一個由IL-28R1和IL-10R2組成的異二聚體受體復合物，其中IL-28R1為結合亞基，IL-10R2為輔助亞基。IL-28R1是IL-29和IL-28的共用受體中所特有的結合亞基，對IL-29的細胞應答具有特異性，輔助亞基IL-10R2是I型干擾素、IL-10、IL-22和IL-26的受體組成部分，其在造血和非造血細胞中普遍表達，對IL-29的細胞應答無特異性。

人IL-29與I型干擾素共享相同的Jak-STAT(janus?kinase-signal?transducer?of?transcription)信號傳導途徑，激活相同的Jak-STAT信號轉導途徑，促進一組共同的基因表達。IL-29首先與其受體結合形成IL28R1-IL29-IL10R2三元絡合物，然后通過定位在細胞內的兩條受體鏈轉導信號，啟動信號級聯反應，使STAT1、STAT2、STAT3、STAT4和STAT5的酪氨酸殘基磷酸化，促使ISGF3(IFN-stimulated?gene?factor?3complex)進入細胞核與ISRE(IFN-stimulated?response?element)相互作用，從而調節基因的轉錄。因此，IL-29表現出一些與I型干擾素相同的性質，如抗病毒、抗增殖、體內抗腫瘤以及免疫調節等生物學活性。

研究發現，人IL-29主要在上皮細胞中進行表達，在人血液、大腦、肺、胰臟及睪丸中則有低水平的表達。不同起源的造血和非造血細胞被各種病毒感染后，可誘導表達IL-29，目前已發現有麻疹病毒、腮腺炎病毒、心肌炎病毒、甲型流感病毒、仙臺病毒、新城雞瘟病毒、單鏈(+)RNA病毒、雙鏈DNA病毒等可誘導感染細胞表達IL-29。

IFN是發現最早、研究最多、第一個克隆化和用于臨床治療疾病的細胞因子。目前，IFN主要用于某些腫瘤和病毒性疾病的治療，但對不同的腫瘤和病毒性疾病的療效差異很大，且常出現不良反應。IL-29的結構和功能與I型IFN相似，且能選擇性地作用于不同類型的靶細胞，其可作為I型IFN(IFN-α、IFN-β)的替代品或輔助品用于某些疾病的治療，在腫瘤、器官移植、自身免疫性疾病及變態反應性疾病等防治方面具有潛在的應用價值。

發明內容

本發明提供了一種人白細胞介素29成熟肽第33位賴氨酸定點突變為精氨酸的變異體(hIL-29L)及其制備方法。

本發明提供的技術方案如下：

(1)本發明的第一方面，提供一種插入了hIL-29成熟肽第33位賴氨酸定點突變為精氨酸的變異體編碼基因的重組真核表達載體，將本發明所述的hIL-29變異體編碼基因(SEQ?ID?No：2)與pPIC9K^M(源于Invitrogen公司，經本實驗室改造并已申請專利，申請號為：201110410391.0)重組，獲得重組真核表達載體pPIC9K^M-hIL-29L，如圖1所示；該重組載體表達產物是肽鏈中第33位賴氨酸定點突變為精氨酸的hIL-29變異體(SEQ?ID?No：1)；而且，本發明將pPIC9K^M的α因子中的限制性內切酶Xho?I識別位點CTC?GAG與蛋白酶Kex2的識別位點GAG?AAA?AGA，通過PCR方法引入hIL-29變異體編碼基因(SEQ?ID?No：2)的氨基端，使該重組真核表達載體表達的hIL-29變異體(SEQ?ID?No：1)的肽鏈不會因引入限制性內切酶位點而增加額外的氨基酸殘基。