[發明專利]一株高產堿性木聚糖酶的巴斯德畢赤酵母及其應用

在審

• 申請號: 201410753232.4
• 申請日: 2014-12-09
• 公開（公告）號: CN104450542A
• 公開（公告）日: 2015-03-25
• 發明（設計）人: 徐曉東;李冬冬;肖志壯;王海
• 申請（專利權）人: 青島蔚藍生物集團有限公司;濰坊康地恩生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/16
• 分類號: C12N1/16;C12N9/42;C12R1/84
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 曾慶國

技術領域

本發明屬于功能微生物菌株篩選技術領域，具體涉及一株高產堿性木聚糖酶的巴斯德畢赤酵母及其應用。

背景技術

木聚糖(xylan)是植物半纖維素的主要成分，廣泛存在于自然界中，其含量僅次于纖維素是第二豐富的多聚糖。木聚糖酶(Xylanase)是指能專一降解半纖維素木聚糖為低聚木糖和木糖的一組酶的總稱。目前木聚糖酶在飼料、烘焙、啤酒、造紙、紡織、醫藥及能源等領域得到了日益廣泛的應用。在造紙工業中，木聚糖酶可以應用于生物制漿、紙漿漂白、廢紙脫墨處理等，特別是其在紙漿生物漂白中，木聚糖酶與傳統的氯漂白配合，促使紙漿中殘余木質素的降解和溶解性木質素的抽除，不但可以提高紙漿的白度和白度穩定性，改善纖維的濾水性和造紙性能，而且可以降低后續工藝化學物質的用量，減少富含氯化物的工業廢水的排放，從而降低紙漿漂白對環境產生的污染。

目前，以無元素氯和全無氯漂白工藝為代表的紙漿漂白已經成為世界各國造紙業紙漿漂白發展的必然趨勢，木聚糖酶酶法助漂新工藝已在歐洲和北美的30余家大型紙廠得到應用，丹麥諾維信公司等多家酶制劑廠商，紛紛推出了專門用于紙漿漂白的木聚糖酶和纖維素酶新產品。但目前為止，工業上用的木聚糖酶主要來自細菌和真菌，報道較多及產酶活力較高的微生物主要是黑曲霉、木霉和青霉等真菌，它們所產的酶大多為中性偏酸的木聚糖酶，最適反應溫度大多在50℃以下。而在造紙工業中，紙漿蒸煮和漂白工藝基本都是在高溫和強堿的條件下進行，使得現有的酸性或中性木聚糖酶產品受到了極大的限制。因此，研究開發具有優良特性的堿性木聚糖酶具有重大經濟效益和社會效益，具有更廣的應用前景。

發明內容

本發明的目的是提供一種高產堿性木聚糖酶的巴斯德畢赤酵母突變菌株，是由構建得到的巴斯德畢赤酵母工程菌經紫外誘變獲得的，其能大幅度提高堿性木聚糖酶的表達量，且不影響堿性木聚糖酶的酶學性質和應用效果。

本發明一方面提供了一株突變菌株巴斯德畢赤酵母(Pichia?pastoris)XynH1，該菌株已于2014年12月4日保藏于中國武漢武漢大學的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC?NO：M2014624。

上述的巴斯德畢赤酵母XynH1是通過紫外誘變獲得的。

本發明另一方面提供上述巴斯德畢赤酵母XynH1在堿性木聚糖酶生產中的應用。

在發酵罐上進行巴斯德畢赤酵母XynH1和巴斯德畢赤酵母XD的發酵，發酵使用的培養基配方為：硫酸鈣1.1g/L、磷酸二氫鉀5.5g/L、磷酸二氫銨55g/L、硫酸鉀20.3g/L、硫酸鎂16.4g/L、氫氧化鉀1.65g/L、消泡劑0.05％。

發酵生產工藝：pH值5.0、溫度25℃、攪拌速率300rpm、通風量1.0-1.5(v/v)、溶氧控制在20％以上。

本發明通過紫外誘變的方法獲得一株突變菌株巴斯德畢赤酵母XynH1，其發酵上清液酶活高達6982U/mL，比出發菌提高了88％，且突變菌株重組表達的木聚糖酶的酶學性質并未因突變發生變化，與出發菌幾乎相同。該巴斯德畢赤酵母XynH1突變菌株重組表達的木聚糖酶在堿性條件下具有很高的活性，可廣泛應用于造紙領域。

附圖說明

圖1：SDS-PAGE蛋白電泳圖；

其中，泳道1為宿主菌巴斯德畢赤酵母發酵上清液，泳道2為陽性轉化子發酵上清液，箭頭所指20kD附近可以看到清晰的蛋白條帶，即為重組表達的木聚糖酶。

圖2：突變菌與出發菌發酵上清液中木聚糖酶相對酶活-pH變化曲線。

圖3：突變菌與出發菌發酵上清液中木聚糖酶相對酶活-溫度變化曲線。

圖4：突變菌與出發菌發酵罐發酵進程曲線。

具體實施方式

下面結合實例對本發明的方法做進一步說明，下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常可按常規條件，如J.薩姆布魯克(Sambrook)等編寫的《分子克隆實驗指南》中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件運行。本領域相關的技術人員可以借助實施例更好地理解和掌握本發明。但是，本發明的保護和權利要求范圍不僅限于所提供的具體案例，而應包括本領域技術人員在本說明書基礎上，不需經過創造性勞動就能擴展的保護范圍。

實施例1：出發菌株的構建