[發明專利]選育納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌共發酵制備富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的玉米汁的方法

在審

• 申請號: 201410751014.7
• 申請日: 2014-12-10
• 公開（公告）號: CN104522789A
• 公開（公告）日: 2015-04-22
• 發明（設計）人: 阮暉;徐薇薇;蔡宇晶;林永華;胡慧雯;張哲滔;莫凡
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: A23L2/04
• 分類號: A23L2/04;A23L1/29;C12N15/03;C12N15/01;C12R1/07;C12R1/245
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

1.一種選育納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌共發酵制備富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的玉米汁的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)、將產納豆激酶兼吡咯喹啉醌的納豆芽孢桿菌10261和納豆芽孢桿菌10263分別進行亞硝基胍誘變；然后混合二者誘變后代，進行細胞融合傳代培養，高通量篩選得到高產納豆激酶兼吡咯喹啉醌的納豆芽孢桿菌，命名為納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-301；

2)、將干酪乳桿菌進行亞硝基胍誘變，從中篩選出甲硫氨酸營養缺陷型的干酪乳桿菌，命名為干酪乳桿菌LcS-Met-；

3)將納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-301和干酪乳桿菌LcS-Met-共發酵玉米汁，得到富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的玉米汁。

2.根據權利要求1所述的選育納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌共發酵制備富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的玉米汁的方法，其特征在于，步驟1)中，所述的高通量篩選具體包括：①制備2個平板豆芽汁玉米汁固體培養基，其中一個將小鼠抗PQQ?IgG單抗PQQ-mAb配入，形成平板A，另一個將瓊脂糖-纖維蛋白配入，形成平板B；②將納豆芽孢桿菌10261和納豆芽孢桿菌10263的誘變融合后代涂布其中一個平板后，再用纖維素膜影印至另一個平板，使平板A和平板B互為影印平板；③平板A中，高產吡咯喹啉醌的誘變融合后代菌落周圍形成肉眼可見沉淀圈，根據沉淀圈直徑大小可肉眼判斷產吡咯喹啉醌量大小；④平板B中，高產納豆激酶的誘變融合后代菌落周圍形成透明圈，根據透明圈直徑大小可肉眼判斷產納豆激酶活力高低；⑤平板A與平板B中，高產吡咯喹啉醌菌落與高產納豆激酶菌落處于同一位置者，即為高產納豆激酶兼吡咯喹啉醌的納豆芽孢桿菌。

3.根據權利要求2所述的選育納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌共發酵制備富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的玉米汁的方法，其特征在于，步驟1)中，所述的平板豆芽汁玉米汁固體培養基以1L計，由以下量的組分組成：

4.根據權利要求1所述的選育納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌共發酵制備富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的玉米汁的方法，其特征在于，步驟2)中，所述的從中篩選出甲硫氨酸營養缺陷型的干酪乳桿菌，具體包括：①制備2個平板MRS固體培養基，其中一個將甲硫氨酸配入，為平板C，另一個為單純MRS固體培養基平板，為平板D；②將誘變后的干酪乳桿菌涂布其中一個平板后，再用纖維素膜影印至另一個平板，使平板C和平板D互為影印平板；③在平板C與平板D的同一位置，平板C出現菌落而平板D未出現菌落，或平板C上的菌落顯著大于平板D上的菌落，則該菌落為甲硫氨酸營養缺陷型干酪乳桿菌。

5.根據權利要求4所述的選育納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌共發酵制備富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的玉米汁的方法，其特征在于，步驟2)中，所述的平板MRS固體培養基以1L計，由以下量的組分組成：

該MRS固體培養基的pH值保持在6.2～6.4。

6.根據權利要求1所述的選育納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌共發酵制備富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的玉米汁的方法，其特征在于，步驟3)中，在共發酵之前，將納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-301和干酪乳桿菌LcS-Met-分別進行活化培養，納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-301在豆芽汁玉米汁液體培養基中進行活化培養，培養溫度為34～36℃，干酪乳桿菌LcS-Met-在MRS液體培養基中進行活化培養，培養溫度為36～38℃。

7.根據權利要求6所述的選育納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌共發酵制備富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的玉米汁的方法，其特征在于，步驟3)中，所述的豆芽汁玉米汁液體培養基以1L計，由以下量的組分組成：

玉米汁???????????100～150mL；

蔗糖??????????????4.0～6.0g；

豆芽汁?????????????????余量；

所述的MRS液體培養基以1L計，由以下量的組分組成：

該MRS液體培養基的pH值保持在6.2～6.4。