[發(fā)明專利]一種四環(huán)素耐低氧菌種的構(gòu)建方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201410748432.0 | 申請日： | 2014-12-09 |
| 公開（公告）號： | CN104726483A | 公開（公告）日： | 2015-06-24 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 張燕玉;馬學霞;李學兵;孫瑞君;崔莉 | 申請（專利權(quán)）人： | 寧夏啟元藥業(yè)有限公司 |
| 主分類號： | C12N15/76 | 分類號： | C12N15/76;C12N1/21;C12R1/49 |
| 代理公司： | 寧夏專利服務(wù)中心 64100 | 代理人： | 徐淑芬 |
| 地址： | 750101 寧夏回族自*** | 國省代碼： | 寧夏;64 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 四環(huán)素 低氧 菌種 構(gòu)建 方法 | ||
1.一種四環(huán)素耐低氧菌種的構(gòu)建方法，其特征在于其工藝包括：
大腸桿菌ET12567菌體感受態(tài)細胞的制備；
將可表達的透明顫菌血紅蛋白基因的質(zhì)粒pSET152轉(zhuǎn)化入大腸桿菌ET12567菌體感受態(tài)細胞中；
將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌ET12567中與金色鏈霉菌進行接合轉(zhuǎn)移，得到四環(huán)素耐低氧菌種。
2.按照權(quán)利要求1所述的四環(huán)素耐低氧菌種的構(gòu)建方法，其特征在于所述大腸桿菌ET12567菌體感受態(tài)細胞的制備過程為：在0-4℃條件下離心收集在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期中期的ET12567菌體，將該菌體懸浮于預(yù)冷至1－5℃的0.1mol/L的CaCl2溶液中,在1－5℃冷浴20-30min，然后繼續(xù)在0-4℃條件下離心，收集菌體即可得到感受態(tài)細胞。
3.按照權(quán)利要求2所述的四環(huán)素耐低氧菌種的構(gòu)建方法，其特征在于所述離心時轉(zhuǎn)速控制在3500－4500r/min。
4.按照權(quán)利要求2所述的四環(huán)素耐低氧菌種的構(gòu)建方法，其特征在于所述對數(shù)期中期是指OD600為0.2-0.6。
5.按照權(quán)利要求2所述的四環(huán)素耐低氧菌種的構(gòu)建方法，其特征在于所述ET12567菌體的培養(yǎng)條件為：33-37℃、180-200r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)。
6.按照權(quán)利要求2所述的四環(huán)素耐低氧菌種的構(gòu)建方法，其特征是：將收集的菌體懸浮于100uL預(yù)冷至1－5℃的0.lmol/L的CaCl2溶液中，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
7.按照權(quán)利要求1所述的四環(huán)素耐低氧菌種的構(gòu)建方法，其特征在于所述將可表達的透明顫菌血紅蛋白基因的質(zhì)粒pSET152轉(zhuǎn)化入大腸桿菌ET12567菌體感受態(tài)細胞中的具體過程為：取ET12567感受態(tài)細胞于EP管中,加入可表達的透明顫菌血紅蛋白基因的質(zhì)粒pSET152,1-5℃冰浴20-40min；39-42℃恒溫水浴中熱激30～50s，立即冰上放置?5～10min；加入適量LB培養(yǎng)基，混勻,35～39℃，180～200r/min搖床恢復(fù)培養(yǎng)30～50分鐘；將轉(zhuǎn)化的菌液涂布于含50～100mg/ml安普霉素?APr的LB平板上；35～39℃倒置過夜培養(yǎng)，篩選轉(zhuǎn)化子。
8.按照權(quán)利要求1所述的四環(huán)素耐低氧菌種的構(gòu)建方法，其特征在于所述ET12567感受態(tài)細胞和可表達的透明顫菌血紅蛋白基因的質(zhì)粒pSET152的體積比為：60-100:5-10。
9.按照權(quán)利要求1所述的四環(huán)素耐低氧菌種的構(gòu)建方法，其特征在于所述將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌ET12567中與金色鏈霉菌進行接合轉(zhuǎn)移的具體過程為：
將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌ET12567接種于加有安普霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，離心收集菌體；
制備金色鏈霉菌孢子懸浮液，將其轉(zhuǎn)入孢子預(yù)萌發(fā)培養(yǎng)基中?，在38-42℃的水浴鍋熱激5-10分鐘后,?冷至室溫，在搖床上培養(yǎng)10-30分鐘；
將上述培養(yǎng)好的金色鏈霉菌孢子液與大腸桿菌菌體混勻，放置1-5分鐘后涂布雙碟，培養(yǎng)，覆蓋萘啶酮酸，PCR驗證即可。
10.按照權(quán)利要求1所述的四環(huán)素耐低氧菌種的構(gòu)建方法，其特征在于所述將構(gòu)建的質(zhì)粒pSET152轉(zhuǎn)化入大腸桿菌ET12567(含有PUZ8002質(zhì)粒)中后，先進行特異性引物PCR鑒定和凝膠成像鑒定，然后再與金色鏈霉菌進行接合轉(zhuǎn)移。
11.按照權(quán)利要求10所述的四環(huán)素耐低氧菌種的構(gòu)建方法，其特征在于所述特異性引物PCR鑒定條件為：94℃預(yù)變性5-10min，然后94℃變性30-45s，62-66℃退火10-30s，72℃退火45-60s，共25-30個循環(huán)，最后72℃延伸5-10min。
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