[發(fā)明專利]一種HBVDNA數(shù)字PCR定量檢測試劑盒及其應(yīng)用

有效

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• 申請日: 2014-12-08
• 公開（公告）號: CN104450963B
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙書民;趙翊均;周巍
• 申請（專利權(quán)）人: 上海五色石醫(yī)學(xué)研究有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司31200
• 代理人: 陸飛,盛志范

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于病毒體外檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種HBV DNA數(shù)字PCR定量檢測試劑盒及其應(yīng)用。

技術(shù)背景

慢性乙型肝炎（Chronic Hepatitis B, CHB）是由于乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus, HBV）在人肝細胞中慢性感染所致的一種肝臟炎癥疾病，其持續(xù)進展可導(dǎo)致肝硬化、肝功能衰竭及肝癌。據(jù)估計，全世界目前有HBV攜帶者約3.5億人，每年約有100萬人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化或肝癌。2012年，由中華醫(yī)學(xué)會肝病分會和中國醫(yī)學(xué)會感染病學(xué)分會聯(lián)合制訂的《慢性乙型肝炎防治指南》指出，目前我國現(xiàn)有的慢性HBV感染者約9300萬，其中CHB患者超過2000萬。

對于CHB，無論是中國版的還是歐洲肝病協(xié)會制訂的《慢性乙型肝炎防治指南》均指出，抗病毒治療是最重要的治療措施。在CHB的抗病毒治療中，核苷（酸）類似物（包括拉米夫定、阿德福韋酯、替比夫定、恩替卡韋、替諾夫韋酯等）以其口服方便、抗病毒療效確切成為CHB患者中應(yīng)用最為廣泛的一類藥物，其中恩替卡韋及替諾福韋酯為國內(nèi)外指南推薦的一線用藥。

無論是采用核苷（酸）類似物還是干擾素等進行抗HBV治療，其抗病毒療效監(jiān)測均需要對CHB患者外周血中的病毒載量進行檢測，即HBV DNA定量檢測。在國內(nèi)外相關(guān)的治療指南中均指出，無論是采用何種抗HBV治療方案，均需要采用HBV DNA定量檢測的方法對抗HBV療效進行評估，理想狀態(tài)下，需將CHB患者外周血中的HBV DNA控制在現(xiàn)有檢測手段檢測不到的水平。當前，國內(nèi)外進行HBV DNA定量檢測采用的方法均為實時熒光PCR方法。國際公認的HBV DNA定量檢測方法是羅氏公司生產(chǎn)的、在國際上具有參比價值的Roche COBAS TaqMan HBV Test檢測試劑盒。依據(jù)這一定量方法，美國肝病協(xié)會指出，在抗HBV治療中，HBV DNA定量水平應(yīng)盡可能小于或等于10 IU/ml，歐洲肝病研究協(xié)會則指出，將HBV DNA定量水平控制在10-15 IU/ml可有效防止疾病復(fù)發(fā)。在我國CFDA于2013年5月發(fā)布的《乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸定量檢測試劑注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則》中則建議HBV DNA定量檢測試劑的最低檢出限應(yīng)小于或等于30 IU/ml。

然而，我國CFDA早期批準的HBV DNA定量檢測試劑，其靈敏度均在500 IU/ml以上，難以達到慢性乙型肝炎臨床診療和我國法規(guī)的最新要求。2009年有學(xué)者以Roche試劑盒為參照，對我國已批準上市的幾種HBV DNA定量檢測試劑進行了評估，結(jié)果表明，5種試劑盒在1×10⁴ －1×10⁸ IU/ml范圍內(nèi)，各種試劑盒的符合率較高。2013年中國食品藥品檢定研究院的學(xué)者以Roche HBV DNA定量檢測試劑為參照，對一檢測靈敏度為500 IU/ml的國產(chǎn)HBV DNA定量檢測試劑的質(zhì)量進行了評估，在193份HBsAg陽性的樣本中，Roche試劑盒檢出HBV DNA的樣本占到了95%，而國產(chǎn)試劑則僅為70%；而在122份HBsAg陰性的樣本中，Roche試劑檢出約31%的樣本HBV DNA呈陽性，其中包括6份“兩對半”結(jié)果均呈陰性的樣本，而國產(chǎn)試劑在這122份樣本中未檢出1例呈HBV DNA呈陽性。這樣的結(jié)果顯示國產(chǎn)試劑盒質(zhì)量有待進一步提高，最為重要的是要提高國產(chǎn)試劑盒對HBV DNA的檢測靈敏度。

研究表明，HBV雖然是一種DNA病毒，但由于HBV DNA聚合酶本身無3’到5’端校正功能，HBV DNA在復(fù)制過程中的自發(fā)突變率較高。依據(jù)HBV DNA序列的相似性，HBV至少可分為A、B、C、E、F、G、H等7種基因型。中國慢性乙型肝炎患者中，則以C型和B型為主。在傳統(tǒng)的HBV DNA實時熒光PCR檢測試劑中，雖然在進行引物設(shè)計時，會考慮到不同基因型HBV間的保守性，但考慮到HBV自身高自發(fā)突變率，一套引物與探針對不同的基因型的覆蓋率是有限的，除檢測試劑自身的靈敏度外，這可能也是國產(chǎn)HBV DNA實時熒光PCR檢測試劑漏檢率高的重要原因之一。要提高對不同基因型HBV的覆蓋，一個可行的方案是通過多重PCR進行檢測，即在HBV DNA多個保守區(qū)域同時進行檢測。由此而帶來的另一個問題是，熒光信號強度與HBV DNA的量間的關(guān)系將不可避免地出現(xiàn)異化。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的就是針對上述對HBV DNA檢測靈敏度的更高需求（包括現(xiàn)實需求和法規(guī)要求），提供一種檢測快速、簡便，特異性強、靈敏度高的HBV DNA數(shù)字PCR定量檢測試劑盒及其應(yīng)用。