[發(fā)明專利]黃曲霉毒素B1免疫親和柱的制備方法及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410726880.0
• 申請日: 2014-12-03
• 公開（公告）號: CN104437408A
• 公開（公告）日: 2015-03-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張東升;袁藝;楊婷婷;張海濤;龔燕;匡群;葉進(jìn);諸建國
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇省蘇微微生物研究有限公司
• 主分類號: B01J20/24
• 分類號: B01J20/24;B01J20/281;B01J20/30;B01D15/38;G01N30/02;G01N33/577;C07K16/14
• 代理公司: 北京商專永信知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11400
• 代理人: 高之波;鄔玥

1.黃曲霉毒素B₁免疫親和柱的制備方法，其特征在于，該方法步驟如下:

(1)固相載體的準(zhǔn)備：將保存的重組蛋白A瓊脂糖凝膠抽干后，用PBS緩沖液洗滌后，用PBS緩沖液懸浮；

(2)抗體與固相載體的偶聯(lián)：

a、將AFB₁單克隆抗體與步驟(1)中得到的固相載體重組蛋白A瓊脂糖凝膠室溫下在垂直混勻器上混合1～3h；

b、反應(yīng)結(jié)束后，用步驟a溶液總體積3～4倍的PBS緩沖液洗滌并抽干，得反應(yīng)物；

c、然后在步驟b所得反應(yīng)物中加入0.2mol/L的三乙醇胺-硼酸溶液和二甲基庚二亞胺二鹽酸鹽DMP固體粉末，室溫下，在垂直混勻器上混勻1～3h；

d、用10～30mL的0.2mol/L的三乙醇胺-硼酸溶液洗滌一次，并用20～40mL、50mmol/L的乙醇胺-硼酸溶液重新懸浮，室溫下，在垂直混勻器上混勻4～6min；

e、用20～40mL的PBS緩沖液洗滌后，抽干，加入5～10mL?50mmol/L，pH3.0的甘氨酸-HCL溶液，室溫下，在垂直混勻器上混勻4～6min；

f、反應(yīng)結(jié)束后，用10～30mL的質(zhì)量濃度為20％乙醇-水洗滌兩次，最后用等體積的20％乙醇-水重新懸浮，得到混懸液；

(3)裝柱：取步驟(2)制備的混懸液進(jìn)行裝柱，沉降，安裝篩板，用質(zhì)量濃度為20％的乙醇-水密封，4℃保存，即得到黃曲霉毒素B₁免疫親和柱。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃曲霉毒素B₁免疫親和柱的制備方法，其特征在于，步驟(1)保存的重組蛋白A瓊脂糖凝膠使用乙醇保存。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的黃曲霉毒素B₁免疫親和柱的制備方法，其特征在于，所述步驟a其中重組蛋白A瓊脂糖凝膠、AFB₁單克隆抗體和步驟(1)懸浮用到的PBS緩沖液體積比為2：3：3。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的黃曲霉毒素B₁免疫親和柱的制備方法，其特征在于，步驟c中反應(yīng)物、三乙醇胺-硼酸溶液、DMP體積比為2:20:100。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的黃曲霉毒素B₁免疫親和柱的制備方法，其特征在于，所述AFB₁單克隆抗體由以下制備方法獲得：

取10～12周齡或產(chǎn)后的雌性BALB/c小鼠，石蠟油或降植烷每只0.5～1mL或石蠟與弗氏不完全佐劑混合液0.4～0.6mL預(yù)刺激，分籠做標(biāo)記；

選取處于生長期的細(xì)胞即穩(wěn)定分泌抗AFB₁單抗的雜交瘤細(xì)胞株，去掉培養(yǎng)液，換成無血清DMEM培養(yǎng)基或無菌生理鹽水，將貼壁細(xì)胞吹下，置入50mL滅菌離心管中，800～1000rpm離心5～8min，去掉上清重新用DMEM懸起細(xì)胞，再離心去上清，加入DMEM培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量為1×10⁶/mL，每只小鼠細(xì)?胞注射劑量為0.5～1.0mL；

接種雜交瘤細(xì)胞株后在10～13天采集腹水，采用分步驟引流收集或一次性收集，腹水4000rpm離心1～5min去細(xì)胞碎片；

辛酸-飽和硫酸銨純化腹水中AFB₁單克隆抗體，AFB₁單克隆抗體濃度在2.0～5.0mg/mL。