[發明專利]一組核苷酸序列及在伊氏李斯特菌鑒定中的應用

在審

• 申請號: 201410725837.2
• 申請日: 2014-12-03
• 公開（公告）號: CN104498487A
• 公開（公告）日: 2015-04-08
• 發明（設計）人: 王毅;葉長蕓;王艷
• 申請（專利權）人: 中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 北京市眾天律師事務所 11478
• 代理人: 李新軍

技術領域

本發明涉及環介導恒溫擴增技術在細菌檢測中的應用，特別是在伊氏李斯特菌鑒別診斷中的應用，屬于分子生物學和微生物學領域。

背景技術

伊氏李斯特菌(Listeria?ivanovii，Liv)，又稱為綿羊李斯特菌，是廣泛存在于環境中的革蘭氏陽性、有運動能力、兼性胞內寄生短桿菌，是重要的人獸共患病病原菌。該病原體主要引起反芻動物致病，導致李斯特菌病的暴發和散發，約占動物李斯特菌病的15％。由伊氏李斯特菌所致的動物李斯特菌病，其臨床表現為發熱、胃腸炎、新生兒敗血癥以及流產，但不能穿過血腦屏障，侵入神經中樞系統。伊氏李斯特菌也能引起人類李斯特菌病。該李斯特菌病的易感人群主要為免疫力低下人群和免疫缺陷人群，前者包括老年人、新生兒和孕婦；后者為腫瘤患者、艾滋病患者和器官移植受體等。人類伊氏李斯特菌病主要臨床癥狀為敗血癥、孕婦流產、死產以及發熱性胃腸炎等。此外，與其他李斯特菌種比較，該病原體在環境、食品中的分布更為廣泛。許多研究表明，伊氏李斯特菌所引起的李斯特菌病被低估。為了給予臨床病人或感染動物準確快速的治療、以及伊氏李斯特菌的流行病學調查，研發一個省時、省力和特異性較高的伊氏李斯特菌檢測方法成為必要。

目前對于伊氏李斯特菌分離鑒定主要依賴于傳統的分離、培養和生化鑒定，該方法耗時大約5到7天，包括二次增菌，選擇培養及后續的生化鑒定，耗時耗力，而且生化結果的判讀依賴于人的主觀判斷，導致結果重復性差，易錯判。隨著核酸診斷技術的快速發展，一些以PCR為基礎的診斷技術(如普通PCR技術，熒光PCR技術)被用于伊氏李斯特菌的快速診斷，然而這些方法依賴于昂貴的儀器設備，需要后續的電泳操作，昂貴的探針合成，以及熟練的操作人員。對于一些條件有限的實驗室無法進行，限制了這些技術的運用。目前運用這些檢測技術診斷伊氏李斯特菌的PCR方法和Real-time?PCR方法，所選擇的目的基因(如iap，Liv22-228)特異性差，極易出現假陽性擴增。此外這些檢測技術的靈敏度差，檢測過程耗時較長，不利于快速檢測和應急檢測。

環介導恒溫擴增技術(Loop-mediated?isothermal?amplification,LAMP)是由Notomi等發明的一種新型核酸特異性擴增技術。該技術具有靈敏度高、操作簡單、產物易檢測等優點，已被廣泛用于分子生物研究和診斷領域。LAMP針對靶核苷酸序列的6個區域設計4條核心引物，利用具有鏈置換活性的Bst?DNA聚合酶在恒溫條件下(60～65℃)實現擴增。

LAMP的4條核心引物，包括2條內引物，即FIP(Forward?inner?primer，FIP)和BIP(Backward?inner?primer，BIP)，2條外引物(F3和B3)。FIP包含Flc(F1區域的互補序列)和F2，即5′-Flc-F2；BIP包含B1c(B1區域的互補序列)和B2，即5′-Blc-B2。此外，兩條環引物(Loop?primes,LF和LB)被增加到反應體系，能夠加速LAMP擴增反應。