[發明專利]基于核酸適體熒光探針HCy5的同型半胱氨酸試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請號: 201410715903.8
• 申請日: 2014-11-30
• 公開（公告）號: CN104597007B
• 公開（公告）日: 2017-02-22
• 發明（設計）人: 陽兵;秦躍
• 申請（專利權）人: 梵美國際再生醫學科技有限公司
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 深圳市神州聯合知識產權代理事務所(普通合伙)44324
• 代理人: 鄧揚

1.一種基于核酸適體熒光探針的同型半胱氨酸試劑盒，其特征在于，主要成分包括：含NH₄Cl、Tris、EDTA-Na₂的紅細胞裂解液；含?MgCl₂的0.2M磷酸緩沖液；同型半胱氨酸標準品；同型半胱氨酸核酸適體熒光探針；所述同型半胱氨酸核酸適體熒光探針為5'和3'兩端分別標記熒光芘分子單體的核苷酸單鏈，該核苷酸單鏈序列為：gggctaatgc?attgccatta?atgcctacct?ttgcctgggt?ggtctaaccc。

2.根據權利要求1所述的一種基于核酸適體熒光探針的同型半胱氨酸試劑盒，其特征在于，所述含NH₄Cl、Tris、EDTA-Na₂的紅細胞裂解液為含有1～280?mmol/L?NH₄Cl,?1~34?mmol/L?Tris,1~2mmol/LEDTA-Na₂,?pH?7.0~7.2；所述含?MgCl₂的0.2M磷酸緩沖液為含有1~10mmol/L?MgCl₂。

3.根據權利要求1或2所述的一種基于核酸適體熒光探針的同型半胱氨酸試劑盒，其特征在于，所述含NH₄Cl、Tris、EDTA-Na₂的紅細胞裂解液、含?MgCl₂的0.2M磷酸緩沖液、同型半胱氨酸標準品、同型半胱氨酸核酸適體熒光探針為配制好直接使用的液體試劑或是使用前需加水溶解的干粉狀態。

4.根據權利要求1~3所述的一種基于核酸適體熒光探針的同型半胱氨酸試劑盒，其特征在于，該試劑盒用于檢測肝素抗凝全血或末梢血中的同型半胱氨酸濃度。

5.一種用權利1~3任一所述基于核酸適體熒光探針的同型半胱氨酸試劑盒來檢測同型半胱氨酸濃度的方法，其特征在于，方法步驟包括：

（1）血樣裂解：將血樣和含NH₄Cl、Tris、EDTA-Na₂的紅細胞裂解液按1:0.5~5體積比混勻，靜置5~30min，再中速離心5~10min，收集上清液；

（2）混合卵育：取20~100μl步驟1）得到的上清液和30~50ul的用含?MgCl₂的0.2M磷酸緩沖液，溶解同型半胱氨酸核酸適體熒光探針得到的同型半胱氨酸核酸適體熒光探針試劑混合，室溫下卵育5~15min，使同型半胱氨酸核酸適體熒光探針與血樣充分結合，得到測試液；

（3）熒光檢測：熒光檢測儀檢測步驟2）得到的測試液50ul，在熒光檢測儀熒光激發后，讀取熒光激發后20至100ns時間段內波長在480~500nm的熒光值；

（4）結果計算：使用生物醫學作圖軟件，參照同型半胱氨酸標準樣品制作的標準曲線，結合步驟3）中檢測到的熒光值計算出血樣中同型半胱氨酸的濃度。

6.根據權利要求5所述的一種用基于核酸適體熒光探針的同型半胱氨酸試劑盒來檢測同型半胱氨酸濃度的方法，其特征在于，所述同型半胱氨酸核酸適體熒光探針試劑中同型半胱氨酸核酸適體熒光探針濃度為200~400?nmol/L，所述同型半胱氨酸核酸適體熒光探針為5'和3'兩端分別標記熒光芘分子單體的核苷酸單鏈，該核苷酸單鏈序列為：gggctaatgc?attgccatta?atgcctacct?ttgcctgggt?ggtctaaccc。

7.根據權利要求6所述的一種用基于核酸適體熒光探針的同型半胱氨酸試劑盒來檢測同型半胱氨酸濃度的方法，其特征在于，所述的同型半胱氨酸核酸適體熒光探針不與同型半胱氨酸結合時，核酸適體處于比較松散的結構，5'和3'兩端的芘分子單體相互游離,?熒光激發后發射波長在?370~?400nm?之間；所述的同型半胱氨酸核酸適體熒光探針與同型半胱氨酸結合時，同型半胱氨酸誘導其發生結構改變，核酸適體5'和3'兩端的芘分子單體相互靠近，形成激發態二聚體，熒光激發后激發態二聚體發射波長在?480?到?500nm之間。