[發明專利]一種蠅防御素突變體及其制備方法和用途

有效

• 申請號: 201410712363.8
• 申請日: 2014-11-28
• 公開（公告）號: CN104404049A
• 公開（公告）日: 2015-03-11
• 發明（設計）人: 李鋼;鄒輝琴;高靜雷;溫靜
• 申請（專利權）人: 四川華德生物工程有限公司
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/70;C12N1/21;C07K14/435;C12P21/02;A23K1/17;A61K38/17;A61P31/00
• 代理公司: 成都高遠知識產權代理事務所(普通合伙) 51222
• 代理人: 李高峽;張娟

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體涉及一種蠅防御素突變體及其制備方法和用途。

背景技術

抗菌肽(Antibacterial?Peptides，ABPs)，又稱抗微生物肽(Antimicrobial?Peptides,AMPs)，廣義上是指廣泛存在于生物體內具有抵御外界微生物侵害，清除體內突變細胞的一類小分子多肽，是生物先天免疫防御系統的一個重要組成部分，在黏膜免疫系統中起重要作用，稱之為“第一道防御體系”或“第一道免疫體系”。抗菌肽廣泛存在于細菌、植物、無脊椎動物及脊椎動物體內，不僅具有廣譜抗細菌能力，而且對真菌、病毒及癌細胞也有一定殺抑作用。此外，還具有穩定、水溶性好、抗菌機理獨特、無耐藥性、對高等動物正常細胞無害等特點，從而顯示了其在醫學和農業上潛在的研究和應用價值。

蠅防御素是來自于家蠅的抗菌肽，其殺菌機制是分子中的二硫鍵與細菌細胞膜的磷脂有很強的親和作用，即大量分子與膜結合在一起，形成寡聚糖體，并在細菌細胞膜上圍成一個離子通道，使細胞內大量K+外流和ATP合成受阻，導致細胞呼吸停止、菌體死亡。研究也發現，防御素附著在細菌表面后，除了本身對細菌的損傷外，還可以使細菌被吞噬細胞吞噬消化，起到調理素的作用。

直接從家蠅中分離提取的蠅防御素難以滿足市場需求，采用基因工程的方式制備重組蠅防御素可以降低成本，但是采用蠅防御素的基因直接在大腸桿菌中表達獲得的重組蠅防御素抗菌活性不高，耐熱活性差，不具備抗胰蛋白酶的活性，實際應用價值低。

發明內容

為了解決上述問題，本發明提供了一種蠅防御素的突變體。

本發明提供了一種如SEQ?ID?NO：2所示的核苷酸序列。

還提供了一種重組載體，它包含SEQ?ID?NO：2所示的核苷酸序列。優選地，所述的重組載體是重組pGEX-4-1質粒。

還提供了一種重組菌，它包含前述的重組載體。優選地，所述的重組菌為重組大腸桿菌。

本發明蠅防御素突變體，它由SEQ?ID?NO：2所示的核苷酸序列編碼。它的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：4所示。

本發明還提供了一種制備前述蠅防御素突變體的方法，包含如下步驟：

(1)取前述的重組菌，接種于含有50ug/mL氨芐青霉素的液體肉湯培養基中，37℃、220rpm震蕩培養12h，然后用含有50ug/mL的氨芐青霉素的液體肉湯培養基重懸至OD₆₀₀為0.1，于37℃培養至OD₆₀₀為0.8，加入IPTG至終濃度為1mM，誘導表達3小時，離心，得菌體；

(2)取菌體，用GST融合蛋白純化試劑盒分離純化，得到結合了GST融合蛋白的樹脂后，加入等體積的濃度為50U/ml的凝血酶溶液，混勻，室溫震蕩10小時，離心，得上清，去除凝血酶，即得。

所述液體肉湯培養基每升包含如下成分：蛋白胨10g、酵母浸出物5g、NaCl?10g，其余為水。

本發明還提供了前述蠅防御素突變體在制備飼料添加劑或抗菌藥物中的用途。

本發明還提供了一種抗菌藥物，它是以前述蠅防御素突變體為活性成分，加上藥學上可接受的輔料制備而成的制劑。

本發明通過基因工程的方式制備得到了純品蠅防御素突變體，其抑菌活性好，耐熱活性佳，具備抗胰蛋白酶的活性，具有良好的市場應用前景。

附圖說明

圖1?SDS—PAGE分析。1泳道為純化LUC-ori融合蛋白；2泳道為純化的LUC-n融合蛋白；9泳道為LUC-n菌懸液總蛋白；8泳道為細胞溶解后上清蛋白；7泳道為溶菌酶，DNA酶，RNA酶酶解后上清；6泳道為酶解后沉淀總蛋白；4，5泳道為上柱前清液，3為第一次洗柱清液。

圖2?SDS—PAGE分析。泳道1為LUC-ori融合蛋白酶切結果；泳道2，3為LUC-n融合蛋白酶切結果，2為5單位凝血酶，3為2.5單位凝血酶；4泳道為LUC-n融合蛋白未酶切結果，箭頭所示為蠅防御素蛋白。

圖3?SDS—PAGE分析。1泳道：突變LUC-n蛋白超濾離心后的離心液；2泳道：LUC-n蛋白經透析袋濃縮后的清液；3泳道：未突變LUC-ori蛋白超濾離心后的離心液；4泳道：LUC-ori蛋白透析袋濃縮后的清液。

圖4抑菌實驗結果。1號樣品：LUC-n融合蛋白酶切液；2號樣品：LUC-ori融合蛋白酶切液；3號樣品：GST蛋白對照；4號樣品：凝血酶對照。

圖5熱處理后的抑菌結果。藍色點為LUC-n熱處理結果，紅點為LUC-ori熱處理結果。

具體實施方式