[發明專利]一種鴨肝炎病毒免疫原及高免血清的制備方法與應用

在審

• 申請號: 201410710085.2
• 申請日: 2014-11-28
• 公開（公告）號: CN104926939A
• 公開（公告）日: 2015-09-23
• 發明（設計）人: 程安春;汪銘書;朱德康;楊喬;陳孝躍
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;C07K16/06;G01N33/569;G01N33/531
• 代理公司: 四川君士達律師事務所 51216
• 代理人: 芶忠義

技術領域

本發明屬于動物免疫學領域，尤其涉及一種鴨肝炎病毒免疫原及高免血清的制備方法與應用。

背景技術

鴨病毒性肝炎(Duck?Viral?Hepatitis，DVH)是由鴨肝炎病毒(Duck?Hepatitis?Virus，DHV)引起的一種高度致死性傳染病，以發病急、病程短、發病率和死亡率高為特點。鴨病毒性肝炎分為3個各自獨立的沒有血清學關系的血清型：I型、II型和III型。其中，血清I型鴨肝炎病毒(DHV-I)又稱鴨甲型肝炎病毒(Duck?hepatitis?A?virus，DHAV)，是目前我國流行的主要鴨肝炎病毒，給我國養鴨業造成了巨大的經濟損失，威脅著養鴨業的健康發展。

鴨甲型肝炎病毒目前發現有三種基因型，即DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3，根據報道，我國目前流行的主要是DHAV-1，三種基因型均屬于小RNA病毒科禽肝病毒屬，病毒粒子呈球形或類球形，核衣殼呈20面體對稱，直徑為20～40nm，無囊膜，胞漿內繁殖，核酸為不分節段的單股正鏈RNA。該病毒對乙醚、氯仿、甲醇、胰酶、硫酸銨、常用消毒劑等有一定程度的抵抗力；能耐受pH3.0的酸性環境；對熱也有較強抵抗力，56℃加熱1小時仍有部分病毒存活。鴨甲型肝炎病毒不能凝集任何動物的紅細胞，可在鴨胚和雞胚的絨毛尿囊腔及雞胚組織、鴨胚肝細胞、鴨胚腎細胞、鵝胚腎細胞等中增殖。

在免疫學相關的實驗研究和生產實踐中，常常涉及到免疫原的制備。其中由于病毒必須在活的宿主細胞中才能增殖，因此獲得的病毒材料實際上是病毒與增殖該病毒的宿主成分的一個混合物。當然，在以病毒作為免疫原的用途中，有的可以直接使用該病毒與宿主成分的混合物作為免疫原，如制備滅活苗或弱毒苗的免疫原，但在有的方面，需要盡可能去除宿主成分，如病毒單克隆抗體?制備中的免疫原，如盡可能去除宿主成分，將在單克隆抗體的篩選中可減少假陽性的非目標雜交瘤細胞；又如在制備診斷檢測用途的病毒多克隆抗體時，需要盡可能去除宿主成分以保證獲得的多克隆抗體的特異性，但由于病毒的培養增殖、形態大小、結構組成等方面的特殊性，不可能像純化細菌那樣方便、快速地獲得純的免疫原，目前為止，還沒有一個通用、簡便的獲得較純凈的病毒免疫原的方法；正是由于獲得較純的病毒免疫原的困難，同時也導致獲得高特異性的高免血清的困難。

發明內容

本發明的目的在于提供一種鴨肝炎病毒免疫原及高免血清的制備方法與應用，旨在解決由于獲得較純的病毒免疫原的困難，同時也導致獲得高特異性的高免血清的困難的問題。

本發明是這樣實現的，一種鴨肝炎病毒免疫原的制備方法，包括以下步驟：

(1)將鴨肝炎病毒在9～10日齡雞胚或10～12日齡鴨胚尿囊腔接種進行增殖，收集36～60h內死亡并且胚體有明顯病變的尿囊液，將尿囊液反復凍融3次，5000r/m離心30min，取上清；

(2)將步驟(1)得到的上清與等量氯仿相混合，4℃作用1h后，5000r/m離心30min，取上清，如此重復兩次；

(3)將步驟(2)中經氯仿離心處理后的上清在40000r/m下離心2h，用PBS溶解沉淀得到鴨肝炎病毒免疫原。

優選地，在步驟(1)中，所述鴨肝炎病毒為血清1型鴨肝炎病毒CH60株或血清3型鴨肝炎病毒CH-1株。

優選地，在步驟(3)中，所述PBS的用量為：20ml尿囊液對應使用0.5ml?PBS，鴨肝炎病毒免疫原含量為1500μg/ml。

本發明進一步提供了一種鴨肝炎病毒高免血清的制備方法，以上述鴨肝炎?病毒免疫原為抗原，包括以下步驟：

(1)將弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑在研缽中研磨均勻，然后邊磨邊加入抗原，研磨充分后得到免疫注射液；

(2)用弗氏完全佐劑與抗原制備而成的免疫注射液1ml在免疫動物背部皮下多點注射進行第一次免疫；其中，免疫注射液的抗原終濃度為500μg/ml；

間隔7～10d后，用弗氏不完全佐劑與抗原制備而成的免疫注射液2ml進行第二次免疫，免疫途經和部位與第一次免疫相同；其中，免疫注射液的抗原終濃度為500μg/ml；

(3)間隔7～10d后，進行第三次免疫，免疫注射液、免疫劑量和注射方法與第二次免疫相同；

(4)間隔7～10d后用生理鹽水稀釋鴨肝炎病毒免疫原至其抗原濃度為500μg/ml，采用耳緣靜脈緩慢注射方式進行第四次免疫，免疫劑量為1ml；

(5)7d以后，用瓊脂擴散法測定血清效價，當免疫動物的瓊擴效價達到1:32及以上時，頸動脈無菌采血分離血清，-20℃保存，即為粗制鴨肝炎病毒高免血清。