[發明專利]豬流行性腹瀉病毒強毒株和弱毒株鑒別診斷用引物及其檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201410696032.X
• 申請日: 2015-08-03
• 公開（公告）號: CN104498623A
• 公開（公告）日: 2015-07-29
• 發明（設計）人: 倪艷秀;何孔旺;郭容利;李彬;俞正玉;茅愛華;呂立新;祝昊丹;周俊明;溫立斌;張雪寒;王小敏;汪偉;胡屹屹
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 張素卿

技術領域

本發明涉及豬流行性腹瀉病毒強毒株和弱毒株鑒別診斷用引物及其檢測試劑盒，屬于生物技術領域。

背景技術

豬流行性腹瀉病毒（Porcine?epidemic?diarrhea?virus，PEDV）是冠狀病毒科冠狀病毒屬的成員。PEDV在臨床上可以引起豬流行性腹瀉（porcine?epidemic?diarrhea，PED），此病以腹瀉、嘔吐、脫水和對哺乳仔豬高致死率為主要特征。1978年，比利時和英國首次報道PED（Pensaert?M?B，de?Bouck?P．A?new?coronavirus—like?particle?associated?with?diarrhea?in?swine．Arch?Virol，1978，58：243-247）。其基因組為單分子線狀正鏈單股RNA，大小為28kb左右，其5’端加帽，3’端為聚A尾，具有感染性。基因組包含有5’-UTR、3’-UTR和至少7個ORF。這7個ORF中有4個編碼結構蛋白：纖突蛋白（S）、小膜蛋白（E）、?囊膜蛋白（M）和核衣殼蛋白（N），另3個編碼非結構蛋白：復制酶（replicase?）1a、復制酶1b和ORF3蛋白，其順序為：5’-replicase?(1a/1b)–S-ORF3–E–M–N–3’。ORF3蛋白編碼一種離子通道蛋白，可調節病毒產生，與病毒的毒力有關；強毒株的ORF3基因長675bp，而弱毒株的ORF3基因都缺少49nt或51nt（Park?SJ,?Moon?HJ,?Luo?Y，et?al.?Cloning?and?further?sequence?analysis?of?the?ORF3?gene?of?wild-?and??attenuated-type?porcine??epidemic

diarrhea?viruses.?Virus?Genes.?2008，36(1)：95-104；?Kai?Wang,?Wei?Lu,?Jianfei?Chen，et?al.?PEDV?ORF3?encodes?an?ion?channel?protein?and?regulates?virus?production.?FEBS?Letters，2012，586（4）：384–391）。M基因不管在弱毒株中，還是在強毒株中，都很保守。

此前，我國尚無鑒別診斷豬流行性腹瀉病毒強毒株和弱毒株的二重RT-PCR方法。常規單重RT-PCR技術僅能鑒定是否是豬流行性腹瀉病毒，不能區分強毒株和弱毒株。對豬流行性腹瀉病毒強毒株和弱毒株的檢測只能通過ORF3基因測序來確定是否缺少49?nt或51nt，操作繁雜、耗時長、成本較高。

因此，基于以上的研究和當前的需求，申請人根據豬流行性腹瀉病毒弱毒株ORF3基因缺少49nt或51nt的特征，設計并合成了2對檢測豬流行性腹瀉病毒的引物，采用RT-PCR方法擴增M基因和ORF3基因，通過擴增片段的數量和分子量大小，判斷是豬流行性腹瀉病毒強毒株還是豬流行腹瀉病毒弱毒株，從而特異、敏感、省時、省力、低成本地鑒別診斷豬流行性腹瀉病毒強毒株和弱毒株。目前其他RT-PCR方法不能解決該問題；基因測序技術需要時間較長，且費時、費力、成本高。因此，該技術可對豬流行性腹瀉病毒強毒株和弱毒株的鑒別診斷和監測起到重要作用。

發明內容

技術問題

本發明的目的在于提供豬流行性腹瀉病毒強毒株和弱毒株鑒別診斷用引物及其檢測試劑盒。

技術方案

本發明通過分析豬流行性腹瀉病毒強毒株和弱毒株的M基因和ORF3基因的序列，在M基因的保守區設計引物和在ORF3基因發生缺失的序列處設計引物。所述的引物對有2對。第1對是PEDV-M正向引物和反向引物，其核苷酸序列如序列表中的SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2。第2對是PEDV-ORF3正向引物和反向引物，其核苷酸序列如序列表中的SEQ?ID?NO.3和SEQ?ID?NO.4。

SEQ?ID?NO.1：5’-TATTCCCGTTGATGAGGTGATTG-3’

SEQ?ID?NO.2：?5’-GCTGAATAGTCGCCGTGTTTTG-3’

該對引物從感染豬流行性腹瀉病毒強毒株或弱毒株的病料提取的總RNA中都可擴增出609bp?DNA片段。