[發明專利]提高西蘭花種子的萊菔硫烷水解產量的預處理方法

在審

• 申請號: 201410678132.X
• 申請日: 2014-11-23
• 公開（公告）號: CN104498547A
• 公開（公告）日: 2015-04-08
• 發明（設計）人: 袁其朋;程立;梁浩;王忠鵬;況鵬群;周筱;劉玉婷
• 申請（專利權）人: 北京化工大學
• 主分類號: C12P13/00
• 分類號: C12P13/00
• 代理公司: 北京思海天達知識產權代理有限公司 11203
• 代理人: 劉萍

技術領域

本發明屬于生物化工領域，涉及一種能顯著提高西蘭花種子水解產生萊菔硫烷產量的預處理方式，以及縮短反應時間的方法。

背景技術

十字花科的植物是目前廣泛認為具有抗癌功能的一類植物。這主要是因為十字花科的植物含有大量的硫代葡萄糖苷(glucosinolates，簡稱GLS)，硫代葡萄糖苷是植物的一種含硫次級代謝產物，目前在植物中已發現了120多種硫代葡萄糖苷，其基本結構如下式所示。硫代葡萄糖苷是水溶性、無揮發性、熱穩定性的離子型化合物。若植物細胞發生破損，硫代葡萄糖水解酶，即芥子硫苷酸酶(myrosinase，thioglucoside?glucohydrolase；EC3.2.3.1)被釋放出來，并水解硫代葡萄糖苷，生成硫酸氫鹽、葡萄糖和一系列葡萄糖苷配基，這些配基在經過分子內的重排形成異硫氰酸酯、硫氰酸酯、腈和少量的環硫腈。目前，有很多研究已經表明異硫氰酸酯有良好的抗癌效果。同時，異硫氰酸酯還具有防止微生物繁殖和間接的抗氧化作用。

硫代葡萄糖苷在有酶和無酶(如加溫、加壓)的條件下都會發生降解，有酶時稱為硫代葡萄糖苷的酶解，無酶則稱為非酶解。硫代葡萄糖苷的非酶解過程非常復雜，主要生成腈類化合物和異硫氰酸鹽，反應產物和反應速度均與外界條件有關。中性條件下主要生成異硫氰酸酯；酸性條件產物以腈為主；在有epithiospecifier?protein(簡稱ESP)和亞鐵離子存在，降解產物主要是環硫腈。

在西蘭花種子中，有90％的硫代葡萄糖苷是葡糖萊菔硫烷(glucophanin，簡稱GRA)。由于ESP蛋白普遍存在于各個品種的西蘭花種子中，因此GRA在西蘭花種子自身的酶催化水解后轉化萊菔硫烷(sulforaphane，簡稱SFA)的轉化率為10％-40％，轉化為萊菔硫烷腈(sulforaphane?nitrile，簡稱SFN)的轉化率為50％-80％。SFA不具有任何細胞毒性，能夠抑制肺癌、食道癌、結腸癌、乳腺癌、肝癌及大腸癌等癌細胞的形成，提高組織谷胱甘肽的水平，誘導細胞合成Ⅱ型解毒酶。但是有很多文獻都均報道未發現SFN有任何抗癌活性。目前萊菔硫烷的制備方法主要有化學合成和天然產物提取。化學法采用立體手性合成的方法，實驗復雜，反應步驟多，副產物多，毒性大，產率低，原料成本高，分離難等缺點，難以實現大規模生產。天然產物提取方法利用西蘭花等十字花科植物中黑芥子酶水解GRA得到SFA，申請號為200510130467.9的中國發明專利申請公開了利用蕓苔屬蔬菜為原料制備萊菔硫烷的方法，由于西蘭花種子中普遍含有ESP蛋白，水解生成大量的SFN，得到的SFA產品少，原料浪費嚴重。申請號為200910037363.1的中國發明專利申請公開了一種從西蘭花芽苗菜中提取多功能萊菔硫烷的方法，該方法需考慮芽苗菜的生長時間，對芽苗菜進行預處理，實驗復雜，且同樣無法完全解決ESP蛋白的問題，因此產率低，成本較高。

發明內容

本發明的目的在于克服西蘭花種子水解產生SFA工藝步驟多，生產過程中GRA損耗大，GRA到SFA的轉化率低等缺點，采用物理擠壓的方法，結合細胞破碎、去除油脂、加熱除水于一體，使得西蘭花種子中的細胞破碎更加完全，減少油脂對GRA的包埋，提高GRA溶出2-3倍，比例達到99.5％，切斷GRA向SFN轉化的通路，提高GRA向SFA的轉化率2-10倍，最終提高SFA的產量5-12倍。

GLS廣泛存在于十字花科植物中，GRA是GLS中的一種，且在西蘭花屬中占總GLS的90％以上。GRA可以被黑芥子酶水解，其主要產物為SFA與SFN，前者為不穩定的中間體通過重排反應生成，后者需要有一種熱敏性蛋白ESP催化生成，反應原理如下：

葡糖萊菔硫烷(2)經酶解生成萊菔硫烷(1)和萊菔硫烷腈(3)

一種利用西蘭花種子制備萊菔硫烷的方法，以十字花科蔬菜為原料，依次包括如下步驟：

A.對西蘭花種子進行物理擠壓

將西蘭花種子進行物理擠壓，保持出油溫度40℃-80℃，油渣出料溫度80℃-130℃，分別回收油脂與去除油脂后的種子殘渣；；

B.黑芥子酶的提取與純化

將未經高溫處理的十字花科植物的種子、花、莖或葉粉碎，超聲破碎后用紗布過濾，得到清液用飽和度55％的(NH₄)₂SO₄水溶液將黑芥子酶沉淀析出；10000r/min離心20分鐘后棄去上清，將沉淀用8000-14000分子量的透析膜透析12小時后得到黑芥子酶粗酶液；

C.純化萊菔硫烷