[發明專利]一種易變山羊草的咖啡因提取物及其提取方法與應用

在審

• 申請號: 201410676553.9
• 申請日: 2014-11-23
• 公開（公告）號: CN104522090A
• 公開（公告）日: 2015-04-22
• 發明（設計）人: 余懋群;鄭明輝;李林;龍海;徐德林;潘志芬;鄧光兵
• 申請（專利權）人: 中國科學院成都生物研究所
• 主分類號: A01N65/44
• 分類號: A01N65/44;A01P5/00
• 代理公司: 四川君士達律師事務所 51216
• 代理人: 芶忠義

技術領域

本發明屬于生物工程領域，特別涉及一種易變山羊草的咖啡因提取物及其提取方法與應用。

背景技術

咖啡因(Caffeine，咖啡堿)為黃嘌呤生物堿，常見有水咖啡因和無水咖啡因兩種。咖啡因是中樞神經系統的興奮藥?？Х纫蛑饕嬖谟谔囟ǚN類的植物中，是一種生物堿。由于可以麻痹入侵植物的昆蟲，所以起到了殺蟲劑的作用，保護植物免受病蟲害。起初在世界上人們主要從咖啡豆中獲得咖啡因，其含量根據咖啡豆的種類不同以及制作工藝不同而有所不同。后來人們發現茶中也含有咖啡因，并且茶中所含的咖啡因量通常取決于制茶的強度。因此綠茶、紅茶、普洱茶中的咖啡因含量是不同的。現在人們主要就是從咖啡豆、茶葉、以及可可中獲得咖啡因。

目前咖啡因天然合成的原料主要來自茶葉，因為咖啡因在茶葉中的含量最高，達2％～5％，并且茶葉在世界范圍種植廣泛，資源豐富。茶葉中，咖啡因主要存在的部位為葉、種子和果實，茶花也有一定量得咖啡因存在，并且咖啡因在幼嫩部位較為豐富，而在衰老部位中幾乎不存在?？Х纫蛟诤瘫究浦参镏械难芯旷r見報道，在植物應答逆境脅迫時候的表達中起到的作用更是少有涉及，易變山羊草(2n＝4x＝28,UUSvSv,Ae.variabilis?syn.Triticumperegrinum(Hack?In?J.Fraser)Marie&Hackel)是禾本科小麥的近緣物種，與小麥進行遠源雜交時可產生可育后代，是小麥育種改良的重要資源。但由于易變山羊草的基因組背景尚未闡明，所以相關代謝研究及其抗性機理方面的研究鮮見報道。

禾谷孢囊線蟲(H.avenae)對小麥、大麥、黑麥、燕麥及多種禾本科牧草具有嚴重危害性，是世界上廣泛存在的病原線蟲，尤其對小麥的生產構成嚴重的威脅。我國自1987年在湖北天門縣發現該病害以來，迄今已在華北、西北、華中以及華東等13個省區市發現有分布，且有逐漸蔓延之勢。目前的主要采用化學農藥防治為主。雖然化學農藥防控線蟲是有效的方法之一，但是它對環境和農產品造成的污染使得該方法缺陷凸顯。因此，尋找安全而又行之有效的生物源的線蟲防治途徑非常必要。

目前國內研究尚未在禾本科植物對病原線蟲的抗性中有咖啡因代謝的相關的報道，隨著近年來轉錄組測序技術的發展，利用轉錄組技術結合比較基因組技術來研究植物抗性的報道呈逐年增長之勢。本研究證明了利用轉錄組技術結合植物代謝物提取及HPLC技術可以高通量的獲得對差異表達基因及相關基因所屬的代謝途徑及產物進行研究。

發明內容

為克服現有技術中存在的缺點與不足，本發明的首要目的在于提供一種易變山羊草的咖啡因提取物的提取方法。

本發明的另一目的在于提供上述提取方法獲得的易變山羊草的咖啡因提取物。

本發明的再一目的在于提供上述易變山羊草的咖啡因提取物的應用。

本發明的目的通過下述技術方案實現：一種易變山羊草的咖啡因提取物的提取方法，具體步驟如下：

取易變山羊草根部清洗后切成片，在80℃烘箱中烘干6小時徹底去除水分，然后用粉碎機粉碎，過60目篩后，把10克粉碎的易變山羊草根部樣放入50毫升的萃取釜中，采用無水乙醇作為夾帶劑，在CO₂提取儀中30MPa，60℃萃取2h，其中CO₂流量控制在1.5LPM，獲得易變山羊草的咖啡因提取物。

所述的CO₂提取儀優選為采用Speed?SFE-2超臨界CO₂提取儀(Applied?SeparationsAllentown?Inc,PA,USA)。

一種易變山羊草的咖啡因提取物由上述的提取方法獲得。

上述易變山羊草的咖啡因提取物用于制備禾谷孢囊線蟲和南方根結線蟲的抗蟲劑。其中易變山羊草源的咖啡因提取物中咖啡因在>0.1％濃度下對禾谷孢囊線蟲和南方根結線蟲都有毒害作用；>0.5％濃度下對感病植物抗性。

本發明利用對禾谷孢囊線蟲(H.avenae)和根結線蟲(Meloidogyne?naasi)具有雙抗作用的材料易變山羊草的根部進行了深度的轉錄組測序。通過對測序結果相關基因的代謝途徑進行分析。首次在易變山羊中發現咖啡因代謝途徑。進一步進行數據驗證和樣品提取及HPLC的分析后發現，使用咖啡因>0.1％濃度的易變山羊草的咖啡因提取物對禾谷孢囊線蟲和南方根結線蟲都有毒害作用。

本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果：