[發(fā)明專利]一種采用超濾法輔助雙水相萃取技術提取乳過氧化物酶的方法

有效

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• 申請日: 2014-11-21
• 公開（公告）號: CN104450639B
• 公開（公告）日: 2017-11-28
• 發(fā)明（設計）人: 姜瞻梅;許曉曦;劉麗麗;車紅霞;付紅巖
• 申請（專利權）人: 東北農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C12N9/08
• 分類號: C12N9/08
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產(chǎn)權代理有限責任公司11139
• 代理人: 孫皓晨,馬鑫

技術領域

本發(fā)明涉及一種提取乳過氧化物酶的方法，特別涉及一種采用超濾法輔助雙水相萃取技術提取乳過氧化物酶的方法。本發(fā)明屬于乳過氧化物酶的提取制備技術領域。

背景技術

乳過氧化物酶(LP)是存在于動物乳中的一種天然抗菌物質(zhì)，在有過氧化氫存在的條件下，乳過氧化物酶能夠催化硫氰酸鹽形成抗菌介質(zhì)，LP的生物學意義是參與自然宿主抵御對微生物的入侵，對動物哺乳期的乳腺和新生嬰兒的腸道病原微生物起到保護作用，LP是由一個包含612個氨基酸的單一多肽鏈組成，分子量約為85kDa，等電點為8.0-8.5，在牛乳中的含量為10-30mg/mL，在文獻中已經(jīng)證明了LP是食品中存在的天然防腐劑并且是安全的。

乳過氧化物酶體系在食品行業(yè)中應用最廣泛的是乳制品，在過去幾十年里，國內(nèi)外學者報道了從原料乳中提取LP的方法，有色譜技術、膜色譜等。色譜技術主要包括離子交換、分子篩、免疫親和色譜等，膜色譜應用較多的是離子交換吸附膜。雖然傳統(tǒng)這些色譜法提取LP純度較高，但是仍有很多缺點，例如耗時較長，回收率較低及成本昂貴，并不適宜大量生產(chǎn)乳過氧化物酶。想要高效率的從牛乳清中提取LP并不是一個簡單的任務，因為乳清中存在大量的雜蛋白，給分離帶來了困難，因此迫切的需要一個效率高、成本低、開發(fā)潛力大的從乳清中分離LP的方法。

與一些傳統(tǒng)的分離方法相比，雙水相萃取技術所使用的分離設備簡單、條件溫和、操作簡單，且其獲得產(chǎn)品的回收率和純度較高。目前，雙水相萃取技術已廣泛地應用于蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物產(chǎn)品的分離和純化，以及藥物有效成分的提取，并逐步向工業(yè)化生產(chǎn)邁進。雙水相萃取體系是由兩種聚合物或是一種聚合物和一種鹽組成的，其原理是依據(jù)物質(zhì)在兩相間的選擇性分配，當物質(zhì)進入雙水相體系后，由于生物分子量大小、電荷作用和各種力(如疏水鍵、氫鍵和離子鍵等)的存在和環(huán)境的影響作用，使其在上相和下相中的濃度不同。對于某一物質(zhì)，只要選擇合適的雙水相體系，控制一定的條件，就可以得到合適的分配系數(shù)，從而達到分離純化之目的。它為生物分子提供生物兼容的環(huán)境，具有連續(xù)操作空間，易于擴大生產(chǎn)的優(yōu)點，并且對環(huán)境無害。國內(nèi)研究報道了利用雙水相法提取脂肪酶、糖化酶、淀粉酶等工藝方法，但是目前還沒有應用雙水相法提取乳過氧化物酶的報道。本發(fā)明利用雙水相技術并結合超濾方法，建立了快速、高效率、低成本的乳過氧化物酶分離提取技術，能夠滿足工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的要求。

超濾膜分離技術具有能耗低、分離過程中物質(zhì)不發(fā)生相變、分離效果好、操作簡便、無副作用、無二次污染、分離產(chǎn)物易于回收等優(yōu)點，已被廣泛應用于工業(yè)生產(chǎn)中的產(chǎn)品分離、純化等。將膜分離技術應用于乳過氧化物酶純化處理，為充分開發(fā)利用乳過氧化物酶提供了一種行之有效的方法。因此本發(fā)明采用超濾膜分離技術，進一步純化雙水相萃取得到乳過氧化物酶，為工業(yè)化生產(chǎn)乳過氧化物酶提供了科學依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術缺陷，提供一種可以用于工業(yè)化生產(chǎn)高回收率和高純化倍數(shù)的，且可用于食品工業(yè)的乳過氧化物酶的提取方法。

本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的：

以牛乳清為原料，以雙水相萃取技術為提取手段，確定雙水相萃取技術中最佳鹽相和聚合物的選擇以及其各自最佳用量、體系pH的工藝條件，并用超濾技術進行進一步純化，最后透析脫鹽和冷凍干燥制得成品，即原料乳清→雙水相提取乳過氧化酶→收集富集乳過氧化物酶的鹽相溶液→鹽相溶液使用超濾分離→離心后收集截留溶液→透析脫鹽→冷凍干燥→乳過氧化物酶粗產(chǎn)品。

具體的，本發(fā)明的一種采用超濾法輔助雙水相萃取技術提取乳過氧化物酶的方法，其特征包含以下步驟：

(1)雙水相萃取乳過氧化物酶：

除去新鮮的牛乳中的脂肪和酪蛋白后得到乳清，在室溫條件下，直接向乳清中連續(xù)添加聚乙二醇(PEG)和鹽并將其置于攪拌器上不斷攪拌，直至聚乙二醇和鹽完全溶解于乳清中，其中聚乙二醇的分子量為6000Da，鹽為MgSO₄，聚乙二醇的終濃度為12-16％(w/w)和MgSO₄的終濃度為10％-14％(w/w)，使用NaOH調(diào)節(jié)體系pH至8.0-9.0，靜止，待兩相完全分離，收集體系的下相，即鹽相部分；

(2)超濾：

將收集的鹽相溶液，使用HCl調(diào)節(jié)pH至6.5-7.5，用超濾膜進行超濾分離，以除去雜蛋白，收集截留溶液，進而達到濃縮純化乳過氧化物酶的目的；

(3)脫鹽處理：

將步驟(2)收集的截留溶液裝入透析袋內(nèi)進行脫鹽；

(4)干燥：