[發(fā)明專利]馬鈴薯致病疫霉二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶基因DGAT2-4及其應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410665651.2
• 申請日: 2014-11-19
• 公開（公告）號: CN104357467A
• 公開（公告）日: 2015-02-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 亓寶秀;李新征;孫美紅;宋憲亮
• 申請（專利權(quán)）人: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N9/10;C12N1/19;A01H5/00
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(一)發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及馬鈴薯致病疫霉二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶(diacylglycerol?acyltransferase,DGAT)DGAT2-4及其應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域。

(二)技術(shù)背景

馬鈴薯致病疫霉能夠?qū)е埋R鈴薯和番茄等重要農(nóng)作物發(fā)生晚疫病，但其菌絲體中三酰甘油(triacylglycerol,TAG)含量高，并含有豐富的長鏈多不飽和脂肪酸(Yen,Stone?et?al.2008；Sun,Liu?et?al.2013)。馬鈴薯致病疫霉基因組測序完成，為克隆、鑒定馬鈴薯致病疫霉TAG合成途徑相關(guān)基因及進(jìn)一步的基因工程應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

三酰甘油由3分子脂肪酸和1分子甘油酯化而成，是脂肪酸和能量的儲藏庫，普遍存在于植物、動物和真菌中。TAG除作為重要的食用油外，還是重要的化工原料。

近年來，通過植物和微生物生產(chǎn)的TAG來替代原油被作為一種可持續(xù)的綠色環(huán)保能源而受到人們的重視。TAG合成途徑主要有兩條，依賴酰基CoA的途徑和不依賴酰基CoA的途徑。依賴酰基CoA的途徑又稱為Kennedy途徑，以酰基CoA作為底物在甘油骨架上進(jìn)行連續(xù)的酰化反應(yīng)。

DGAT是一種跨膜蛋白(細(xì)胞溶質(zhì)DGAT除外)，在依賴酰基CoA的Kennedy途徑中催化TAG合成的最后一步反應(yīng)，將酰基CoA底物加到Sn-1,2-二酰甘油的Sn-3的位置上形成三酰甘油，是植物中儲存油脂積累的限速步驟(Ichihara,Takahashi?et?al.1988；Sebei,Ouerghi?et?al.2006)。DGAT超表達(dá)能夠增加擬南芥種子中油脂的含量(Xu,Francis?et?al.2008)。另外，在大豆、油菜、玉米中也有同樣的結(jié)果(Jako,Kumar?et?al.2001；Zheng,Allen?et?al.2008；Lock,Snyder?et?al.2009)。

克隆、鑒定新的DGAT基因，對利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，在植物或微生物中過量表達(dá)高催化活性的DGAT酶，從而提高植物或微生物中含油量具有重要的意義。

本發(fā)明在馬鈴薯致病疫霉中克隆到1個編碼DGAT的cDNA序列，在DGAT基因的突變體釀酒酵母中誘導(dǎo)表達(dá)這個基因，發(fā)現(xiàn)其編碼產(chǎn)物能夠利用油酸(oleic?acid,OA)合成TAG，證明了其具有二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶活性。

(三)發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明利用同源克隆的方法，從馬鈴薯致病疫霉(Phytophthora?infestans)中克隆到了1個DGAT基因的cDNA全長序列，其編碼的氨基酸序列與其它物種中已鑒定的DGAT氨基酸系列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，該基因?qū)儆贒GAT2，因此將這個基因命名為PiDGAT2-4。其核苷酸序列如SEQ.ID.NO?1所示；其氨基酸序列如SEQ.ID.NO?2所示。

本發(fā)明通過RT-PCR的方法，在馬鈴薯致病疫霉中分離到的與三酰甘油合成相關(guān)的二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶基因DGAT2-4；通過酵母突變體互補(bǔ)實驗鑒定和轉(zhuǎn)基因酵母突變體細(xì)胞內(nèi)三酰甘油含量測定表明，它是一個新的二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶基因，其編碼的二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶能夠?qū)Ⅴ；鵆oA底物加到Sn-1,2-二酰甘油的Sn-3的位置上形成三酰甘油，可以用于提高植物和微生物中油份含量。

該基因cDNA序列如下：

序列表

(1)SEQ?ID?NO?1的信息

(a)序列特征

*長度:1146堿基對

*類型:核酸

*鏈型:雙鏈

*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu):線性

(b)分子類型:cDNA

(c)假設(shè):否

(d)反義:否

(e)最初來源:馬鈴薯致病疫霉

(f)序列描述:SEQ?IN?NO.1

(2)SEQ?IN?NO.2的信息

(a)序列特征

*長度：381氨基酸

*類型：氨基酸

*鏈型：單鏈

*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)：線性

(b)分子類型：蛋白質(zhì)

序列描述