[發明專利]一種棘白菌素B微生物酶轉化方法

有效

• 申請號: 201410657837.3
• 申請日: 2014-11-19
• 公開（公告）號: CN105648000B
• 公開（公告）日: 2019-08-13
• 發明（設計）人: 別一;郭明;袁建棟
• 申請（專利權）人: 重慶乾泰生物醫藥有限公司
• 主分類號: C12P21/04
• 分類號: C12P21/04;C12R1/47
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種棘白菌素B微生物酶轉化方法，具體涉及棘白菌素B轉化為棘白菌素B母核的方法。包括在微生物發酵生成棘白菌素B脫酰酶后提取粗酶，然后通過分批添加粗酶及棘白菌素B的方式進行轉化。本發明方法的摩爾轉化率高，產物濃度高，利于分離純化，且棘白菌素B底物利于回收再利用，降低了生產成本。

技術領域

本發明涉及生物制藥領域，具體地，本發明涉及一種棘白菌素B微生物酶轉化方法。

背景技術

棘白菌素類(Echinocandins)是20世紀70年代末期發現的一組天然產物，具有類似的環狀多肽核心和不同的脂肪酸側鏈的結構特征，能夠非競爭性抑制真菌細胞壁β-1,3-葡聚糖合成酶活性，臨床上作為抗真菌藥物使用。

棘白菌素B ( Echinocandin B，簡稱ECB)由構巢曲霉(Aspergilus nidulans)代謝產生，是棘白菌素類中的一種，其結構如下：

棘白菌素B經脫酰酶作用得到環肽母核(Echinocandin B Nucleus，ECBN)，環肽母核再經過化學修飾可制備得到抗真菌藥物阿尼芬凈(Anidulafungin )。目前對于ECB母核的制備，化學合成方法成本較高，主要采用微生物轉化。微生物轉化具有以下優點：反應條件溫和，產物單一，高度的化學選擇性、區域選擇性和對映體選擇性，易于純化，環境污染小，且能完成一些化學合成難以進行的反應。

棘白菌素B母核（ECBN）具有如下結構：

US7785826B2詳細介紹了ECB轉化ECBN的工藝。此工藝主要流程包括：

將ECB發酵完成以后，離心獲得菌絲體，把菌絲體重新懸浮于水中然后加入脫酰酶進行轉化。但此方法的摩爾轉化率較低，轉化時間長，轉化需耗時20~30h，生產成本較高。

CN103374593A公開了一種在發酵過程中添加棘白菌素B（ECB）底物轉化為棘白菌素B母核的方法；CN102618606B公開了一種棘白菌素類化合物的生物轉化方法，包括，將棘白菌素類化合物、緩沖溶液以及助溶劑混合后，再加入全細胞脫酰基酶進行轉化；當前文獻報道的這些轉化方法，主要是猶他游動放線菌(Actinoplanesutahensis) 或其它基因工程菌發酵產生脫酰酶，然后將底物加入到發酵液中進行轉化。這一轉化體系的缺點在于，存在大量微生物，穩定性差，受發酵液酶活的限制導致投入的ECB底物濃度偏低，產生的ECB母核濃度偏低，整個體系體積較大，不易于分離純化，且體系中大量菌體和ECB等不溶物的存在導致未轉化的ECB難以回收，生產成本較高。

CN103074403B公開了一種將ECB轉化為ECBN的方法，涉及發酵完成后通過加磷酸鹽、超聲、離心、旋蒸濃縮，得到棘白菌素B脫酰酶酶液，然后加入ECB底物進行轉化。該方法不足之處在于粗酶提取過程繁瑣，不利于工業化放大生產；使用旋蒸的方式提取粗酶，由于溫度偏高，易造成蛋白質變性，脫酰酶的活力有負面影響。

因此需要開發一種粗酶提取方式簡單、條件溫和，成本較低，酶活受到的負面影響較小，同時轉化效率高，易于分離純化，ECB易于回收重復使用的工藝。

發明內容

本發明的目的在于，針對現有轉化工藝存在的不足，提供一種高效的將棘白菌素B轉化為棘白菌素B母核的方法。

為達到上述目的，本發明提供以下技術方案：

將棘白菌素B轉化成棘白菌素B母核的方法，包括以下步驟：

1）、發酵能將棘白菌素B脫酰酶表達在胞外的基因工程菌，獲得棘白菌素B脫酰酶；

2）、發酵完成后，將發酵液過濾或離心，得到上清液，向上清液中加入上清液體積的40%~80%(w/v)重量的非重金屬鹽，攪拌2~8小時，過濾或離心，收集沉淀，得到粗酶；