[發(fā)明專利]一種金剛烷胺人工半抗原、人工抗原及其制備方法和應(yīng)用

有效

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• 申請日: 2014-11-17
• 公開（公告）號: CN104402753A
• 公開（公告）日: 2015-03-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊華;邵越水;張巧艷;錢鳴蓉;汪建妹;吳俐勤;肖英平
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院;杭州傲銳生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號: C07C233/47
• 分類號: C07C233/47;C07C231/02;C07K14/47;C07K16/44;G01N33/53
• 代理公司: 杭州天勤知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種金剛烷胺人工半抗原、人工抗原及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

金剛烷胺可以抑制病毒穿入宿主細(xì)胞，并影響病毒的脫殼，抑制其繁殖，在臨床上用于預(yù)防和治療人流感病毒的感染，具有價格低廉、藥效明顯等特點，同時也曾是帕金森綜合癥的治療藥物。但金剛烷胺蓄積會對人體造成嗜睡、失眠、眩暈、抑郁、惡心、食欲減退等多種不良反應(yīng)，具有一定的毒副作用。長期使用金剛烷胺還可使病毒產(chǎn)生不同程度的耐藥性，誘導(dǎo)產(chǎn)生新型耐藥病毒。

然而，2012年11月媒體曝出國內(nèi)養(yǎng)殖的“速生雞”從孵出到端上餐桌只需45天，不法商販為了保證其存活，給雞喂養(yǎng)了大劑量人用藥物來抑制禽類的禽流感等病癥。2012年12月，央視調(diào)查中稱，一些養(yǎng)殖戶為進一步縮短養(yǎng)殖周期，讓原本已經(jīng)是速成品種的白羽雞長得更快，偷偷喂食違禁藥物，其中包括金剛烷胺等抗病毒藥品和地塞米松等激素類藥品。“速成雞”事件的爆發(fā)引發(fā)了全國消費者對禽肉食品安全的廣泛關(guān)注和擔(dān)憂，對建立快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測技術(shù)提出了迫切需求。

目前，對金剛烷胺的檢測主要依靠高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、薄層色譜法(TLC)、質(zhì)譜法(MS)等，但是存在儀器昂貴，檢測費時，并且需要專業(yè)技術(shù)人員進行操作，不能達(dá)到現(xiàn)代檢測對快速、準(zhǔn)確的要求。

免疫分析法可以彌補以上所有缺點，免疫分析法是一種利用抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)檢測各種物質(zhì)(藥物、激素、蛋白質(zhì)、微生物等)的分析方法，建立小分子化合物的免疫分析方法的關(guān)鍵是能夠制造出對小分子化合物具有高親和力和高特異性的抗體。但是，由于包括金剛烷胺在內(nèi)的大多數(shù)小分子化合物(分子量小于1000)，不具有免疫原性，即缺乏T細(xì)胞表位而無法直接誘導(dǎo)動物機體產(chǎn)生特異性抗體，故小分子物質(zhì)被稱為半抗原。通過適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾，在半抗原分子結(jié)構(gòu)的某個位置上帶上端部為活性基團的連接臂，再與大分子載體結(jié)合，生成半抗原-載體偶聯(lián)物(即人工抗原)，人工抗原可以借助T細(xì)胞表位來間接誘導(dǎo)B細(xì)胞的增殖和分化，繼而產(chǎn)生特異性抗體。

現(xiàn)有技術(shù)中還未有金剛烷胺人工半抗原、人工抗原的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種金剛烷胺人工半抗原，該金剛烷胺人工半抗原最大程度地保留了金剛烷胺的特征結(jié)構(gòu)，且具有可以與載體蛋白發(fā)生偶聯(lián)的活性基團，可作為抗原決定簇。

一種金剛烷胺人工半抗原，其分子結(jié)構(gòu)式如(Ⅰ)所示：

本發(fā)明還提供了該金剛烷胺人工半抗原的制備方法，包括以下步驟：

(1)將金剛烷胺與丁二酸酐按摩爾比1:1.1～1.5混合，于100～105℃下攪拌反應(yīng)16～17h，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)水-二氯甲烷萃取，取有機相，得無色油狀產(chǎn)物A；

在該反應(yīng)條件下，無色油狀產(chǎn)物A的得率較高，后處理程序較為簡單，較易提純。步驟(1)的反應(yīng)可在吡啶中進行。

(2)將無色油狀產(chǎn)物A、N-羥基琥珀酰亞胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽按摩爾比1:1.35～1.5:1.35～1.5混合，于20～30℃下攪拌反應(yīng)18～20h，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)洗滌、旋蒸后，得無色油狀產(chǎn)物B；

在該反應(yīng)條件下，無色油狀產(chǎn)物B的得率較高，后處理程序較為簡單，較易提純。步驟(2)的反應(yīng)可在二氯甲烷中進行。

優(yōu)選地，反應(yīng)產(chǎn)物依次用0.1mol/L鹽酸水溶液、雙蒸水、飽和碳酸氫鈉溶液、飽和氯化鈉溶液洗滌。采用如上酸洗、水洗、堿洗、再鹽洗的程序可以除去反應(yīng)體系中偏堿，偏酸的副產(chǎn)物或者雜質(zhì)，以達(dá)到大致提純的目的。

(3)將無色油狀產(chǎn)物B與對氨基苯甲酸按摩爾比1:1混合，于pH9～10、20～30℃下攪拌反應(yīng)3～3.5h，反應(yīng)結(jié)束后調(diào)節(jié)pH至5～6、用乙酸乙酯萃取，取有機相，獲得所述的金剛烷胺人工半抗原。

優(yōu)選地，先將無色油狀產(chǎn)物B溶于四氫呋喃中，得到產(chǎn)物B溶液；將等摩爾量的對氨基苯甲酸溶于四氫呋喃與雙蒸水的混合液中，得到對氨基苯甲酸溶液，然后將對氨基苯甲酸溶液滴加到產(chǎn)物B溶液中，混合。

更優(yōu)選地，四氫呋喃與雙蒸水的混合液中，四氫呋喃與雙蒸水的體積比為2～4:1，最優(yōu)選為2:1。

通過上述方法，在金剛烷胺的N位上引入連接臂，在該修飾位點上引入連接臂能最大程度地保留金剛烷胺的特征結(jié)構(gòu)。

與采用一般的飽和鏈烴作為連接臂相比，本發(fā)明所采用的連接臂中含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)，可使人工半抗原的特異性增強，在溶液中保持構(gòu)象穩(wěn)定，提高所形成的人工抗原(II)的免疫特性。

本發(fā)明還提供了一種金剛烷胺人工抗原，其分子結(jié)構(gòu)式如(Ⅱ)所示：