[發明專利]抗5-甲基-胞嘧啶單克隆抗體及其應用

在審

• 申請號: 201410649239.1
• 申請日: 2014-11-14
• 公開（公告）號: CN104448001A
• 公開（公告）日: 2015-03-25
• 發明（設計）人: 金洪傳;王嫻;馮利鋒;陳定偉;許首芳
• 申請（專利權）人: 杭州博譜醫藥科技有限公司
• 主分類號: C07K16/44
• 分類號: C07K16/44;C12N15/13;G01N33/577
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 張法高

技術領域

本發明涉及兔抗5-甲基-胞嘧啶單克隆抗體，抗體重組cDNA序列，蛋白序列及使用該抗體用于檢測DNA中5-甲基-胞嘧啶的相關方法。

背景技術

表觀遺傳修飾(包括DNA甲基化，組蛋白甲基化、乙酰化等)的發現是對生命體遺傳圖譜的重要補充，研究表明表觀遺傳修飾在正常的生理狀態中發揮十分重要的作用，例如胚胎初期的基因印跡，X染色體失活，染色體穩定等。

近年來研究發現，惡性腫瘤的發生發展不僅僅是細胞內各種基因突變的結果，更同表觀遺傳調控網絡的紊亂密切相關。

DNA甲基化修飾，作為DNA本身的化學修飾，是表觀遺傳調控網絡的主要組成部分之一。DNA甲基化修飾是指構成DNA的堿基之一胞嘧啶(C)的5位有被甲基化修飾成5-甲基-胞嘧啶(5-mC)的情況。DNA甲基化修飾主要發生在DNA序列中的CpG區域中的C上。

近年來的研究揭示，DNA甲基化異常在惡性腫瘤發生發展中起重要作用。例如，抑癌基因的啟動子CpG島(CGI)高甲基化是腫瘤發生中頻發的早期事件，并且常表現出腫瘤特異性的“表觀基因組”。迄今為止，已發現許多與細胞凋亡增殖等基本生命活動相關的抑癌基因在腫瘤細胞中因啟動子高甲基化而表達沉默。啟動子區DNA的甲基化也因此被廣泛用于新抑癌基因的發現和鑒定(1-8)。

而且現有研究發現人體外周血中也存在DNA包括甲基化修飾的DNA，不同的生理或病理狀態下DNA的量，甲基化DNA的量和種類也各有不同，可以很好的表征不同的生理和病理狀態。因此檢測外周血中特異的甲基化DNA可以用于各種病理狀態(尤其是癌癥)的診斷輔助和預后預測等。

作為用于檢測甲基化DNA的重要工具之一，特異性的甲基化DNA抗體的制備，以及使用該特異性抗體免疫沉淀，富集甲基化DNA，然后可以分析特定的DNA甲基化情況，也可以用于微列陣芯片分析總的DNA甲基化狀態。

目前市場上也有多種識別5-甲基-胞嘧啶的抗體出售。例如Zymo?Research的5-mC抗體(鼠單克隆抗體)等。另外也有相關的5-mC抗體的專利(包括特開2003-125766號公報和申請號為：201080042414.0等)。

發明內容

本發明旨在以制備兔特異性抗5-甲基-胞嘧啶單克隆抗體及以此為基礎的甲基化DNA檢測方法，提供大腸癌等相關腫瘤診斷、預防或治療中的應用。

目前市場上已有的5-甲基胞嘧啶抗體親和能力不一，特異性不一，這些抗體對甲基化DNA的檢測靈敏度和特異性都不一而足，存在檢測不到低豐度樣本及出現假陽性的可能。

本發明鑒于上述事實，旨在制備一種高親和力、高特異性的5-甲基-胞嘧啶單克隆抗體。

為實現發明目的，發明人提供如下技術方案：

一種抗5-甲基-胞嘧啶單克隆抗體包括：

SEQ?ID?NO:1所示的重鏈氨基酸序列；

SEQ?ID?NO:2所示的輕鏈氨基酸序列。

一種編碼如權利要求1所述抗體的DNA序列包括：

SEQ?ID?NO:3所示的重鏈cDNA序列；

SEQ?ID?NO:4所示的輕鏈cDNA序列。

所述抗體的應用是用于DNA甲基化檢測。

利用兔子特有的免疫系統，能產生比鼠具有更高親和力，更高特異性的抗體，而且兔子的免疫球蛋白(IgG)只有一種亞型，體外克隆重組生產極其方便。以5-甲基胞嘧啶鹽酸鹽(Sigma-M6751)與BSA(牛血清白蛋白)交聯作為免疫抗原。然后用該抗原免疫新西蘭大白兔，將從該免疫后新西蘭大白兔的抗體產生細胞(脾臟細胞)和骨髓瘤細胞進行細胞融合制備雜交瘤細胞，篩選能產生高特異性和高親和力結合5-甲基胞嘧啶的抗體，進而通過分子克隆技術獲得表達該抗體的特異cDNA，用于體外重組生產該抗體，從而完成本發明。

本發明從實驗得知，該5-甲基胞嘧啶兔單克隆抗體能特異性的結合5-甲基胞嘧啶(ELISA法)，而對胞嘧啶的結合能力很低。因此表明，該抗體具有特異性結合5-甲基胞嘧啶的能力。

作為優選，根據本發明所述的5-甲基胞嘧啶特異性兔單克隆抗體為基礎的檢測手段，包括ELISA、Med-IP、PCR、實時定量PCR和微陣列分析。

附圖說明

圖1為5-甲基胞嘧啶交聯BSA作為免疫抗原的交聯結果電泳圖；

圖2為5-甲基胞嘧啶交聯OVA作為免疫后血清檢測原的交聯結果電泳圖；

圖3為胞嘧啶交聯OVA作為免疫后血清檢測原的交聯結果電泳圖；

圖4為體外重組生產抗體純化后SDS-PAGE跑膠鑒定結果；