[發(fā)明專利]一種HtrA2融合基因及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410644113.5
• 申請日: 2014-11-14
• 公開（公告）號: CN104357470A
• 公開（公告）日: 2015-02-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 姜長安;張婷;胡袁
• 申請（專利權(quán)）人: 四川大學(xué)華西第二醫(yī)院
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N15/10;A61K48/00;A61P25/28;A61P25/16;A61P25/00
• 代理公司: 成都天嘉專利事務(wù)所(普通合伙) 51211
• 代理人: 鄒翠

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種HtrA2融合基因及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

線粒體受損是器官退化性疾病的共同病理特征之一。已知的退行性神經(jīng)疾病中，有不少是由于變性蛋白損傷了線粒體的結(jié)構(gòu)和功能所引起的。例如老年癡呆癥相關(guān)的Aβ蛋白片段、帕金森氏病相關(guān)的突變α-Synuclein蛋白、肌肉萎縮性側(cè)面硬化病相關(guān)的突變SOD1蛋白等，都可以在線粒體表面或內(nèi)部積累，并形成不溶性的蛋白聚集體，破壞線粒體結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。除了這些由突變基因所引起的變性蛋白積累，在老年人的神經(jīng)元中，由于蛋白合成的準(zhǔn)確率以及蛋白酶體的活力下降，部分在細(xì)胞質(zhì)里合成的線粒體蛋白存在突變卻不能被及時降解清除。當(dāng)它們轉(zhuǎn)運進(jìn)入線粒體后，也能形成不溶性蛋白聚集體，引起線粒體的結(jié)構(gòu)損傷，導(dǎo)致老年性的退行性神經(jīng)元死亡。

目前已有的線粒體保護(hù)技術(shù)很少，而且都“治標(biāo)”不“治本”。由于變性蛋白在線粒體中積累后往往引起氧化性自由基的大量產(chǎn)生，造成線粒體的進(jìn)一步氧化損傷，已有各種技術(shù)主要是通過把抗氧化藥物送入細(xì)胞或線粒體，以期降低氧化性自由基水平。例如文獻(xiàn)“Protective?effect?of?pyrroloquinoline?quinone?against?Aβ-induced?neurotoxicity?in?human?neuroblastoma?SH-SY5Y?cells”（Neurosci?Lett.?464:165-169）和“Involvement?of?ERK1/2?pathway?in?neuroprotective?effects?of?pyrroloquinoline?quinine?against?rotenone-induced?SH-SY5Y?cell?injury”（Neuroscience?270:183-191），報道了吡咯喹啉醌（Pyrroloquinoline?quinine，PQQ）對神經(jīng)細(xì)胞線粒體的保護(hù)作用。PQQ是最近幾年發(fā)現(xiàn)的最有效的線粒體抗氧化劑之一，能降低心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞以及其它細(xì)胞線粒體中的氧化性自由基，也能在一定程度上緩解Aβ蛋白片段等變性蛋白所引起的線粒體損傷。但由于PQQ并不直接抑制變性蛋白的線粒體轉(zhuǎn)運或清除線粒體中的變性蛋白，因此它不能改變線粒體損傷的根源，效果也往往不太理想。

因此，降低變性蛋白在線粒體內(nèi)部的積累是當(dāng)前退行性神經(jīng)疾病預(yù)防治療中亟待解決的技術(shù)問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種HtrA2融合基因，能用于防止變性蛋白在線粒體內(nèi)積累。該基因由線粒體外膜蛋白USP30的定位序列與HtrA2的蛋白酶功能域及PDZ功能域融合而成（以下稱Mitochondrial?Outer?Membrane?HtrA2，簡稱MOM-HtrA2）。在細(xì)胞里表達(dá)后，MOM-HtrA2蛋白能靶向定位到線粒體表面，將企圖進(jìn)入線粒體的各種變性蛋白降解，防止它們在線粒體內(nèi)部積累。

為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：

一種HtrA2融合基因，其特征在于：該HtrA2融合基因的DNA序列為SEQID?NO:1。

本發(fā)明的HtrA2融合基因為MOM-HtrA2融合基因，5’端的201個堿基編碼USP30的線粒體外膜定位系列，而3’端的975個堿基編碼HtrA2的蛋白酶功能域和PDZ功能域。兩段序列間由GGATCT序列鏈接。

本發(fā)明的HtrA2融合基因在線粒體保護(hù)中的應(yīng)用。

線粒體蛋白酶HtrA2主要有兩種蛋白亞型，較長的HtrA2L和較短的HtrA2S。一般認(rèn)為，HtrA2S分布在線粒體內(nèi)外膜間隙中，能降解其周圍的變性蛋白，是保護(hù)線粒體的主要亞型。實驗證明，HtrA2L雖然蛋白水平很低，但也能發(fā)揮很重要的保護(hù)功能。與HtrA2S不同，HtrA2L分布在線粒體外膜上，是線粒體蛋白轉(zhuǎn)運通道的“門衛(wèi)”，能把即將進(jìn)入線粒體的變性蛋白在線粒體表面及時降解，防止它們在線粒體內(nèi)部積累。一般細(xì)胞中的HtrA2L水平很低，因此它們抵御變性蛋白以及蛋白酶體抑制的能力有限。