[發(fā)明專利]人口腔鱗癌CAL?27?CDDP耐藥細胞株

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410640793.3
• 申請日: 2013-01-17
• 公開（公告）號: CN104371977B
• 公開（公告）日: 2017-08-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王海峰;洪誼;姚遠颋;談竹君;勞昕元
• 申請（專利權(quán)）人: 勞昕元
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09;A01K67/027;C12R1/91
• 代理公司: 上海弼興律師事務(wù)所31283
• 代理人: 薛琦

本申請是以下申請的分案申請：申請日，2013年1月17日；申請?zhí)枺?01310017722.3；發(fā)明創(chuàng)造名稱，人口腔鱗癌CAL-27耐藥細胞株的培養(yǎng)方法及培養(yǎng)所得的細胞株。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種人口腔鱗癌CAL-27-CDDP耐藥細胞株。

背景技術(shù)

在我國，口腔頜面部的惡性腫瘤以癌為最常見，肉瘤較少。在癌瘤中又以鱗狀細胞癌為最多見，一般占80％以上；其次為腺性上皮癌(如黏液表皮樣癌、腺癌、腺樣囊性癌、惡性多形性腺瘤、腺泡細胞癌等)及未分化癌。鱗狀細胞癌常向區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，晚期可發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移。針對鱗狀細胞癌，雖然目前已經(jīng)開發(fā)出了很多的治療藥物并且已經(jīng)被有效應用于臨床上，然而，在眾多的化療過程中經(jīng)常遇到耐藥和多藥聯(lián)用耐藥的情況。耐藥性一般由眾多因素導致，其中不容忽視的是個體化基因的差異，差異基因的篩查與深入的耐藥分子機制研究對未來的臨床治療有很深遠的意義。傳統(tǒng)誘導與篩選的方法建立的口腔鱗癌細胞株由于大劑量給藥對細胞狀態(tài)影響較大，造成差異基因的人為改變，不利于后期篩查。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是為了克服目前常規(guī)方法篩選得到的人口腔鱗癌耐藥細胞株容易因人為因素造成基因改變的缺陷，而利用人口腔鱗癌CAL-27細胞作為親本細胞，選用臨床常用腫瘤化療藥物作為篩選藥物，在體外模擬人體體內(nèi)給藥后藥物的真實作用過程，從而建立起一套穩(wěn)定有效的耐藥細胞株篩選體系和方法。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案之一是：

一種人口腔鱗癌CAL-27耐藥細胞株的培養(yǎng)方法，其包括如下步驟：

(1)在細胞培養(yǎng)皿中種植人口腔鱗癌CAL-27親本細胞，細胞長至貼壁后待融合率達到30～40％時加入篩選藥物，初始濃度采用該藥物的IC₂₀值，連續(xù)作用24～72小時后洗去死細胞并擴增存活的細胞；

(2)待細胞重新處于對數(shù)生長期時，將細胞重復步驟(1)中所述洗去死細胞并擴增存活的細胞的操作，并將篩選藥物的濃度提高一倍進行作用，在篩選藥物的濃度提高至第一定值時，降低藥物濃度增加倍數(shù)，在篩選藥物的濃度加至第二定值時，將細胞經(jīng)過凍存后復蘇細胞，即制得人口腔鱗癌CAL-27耐藥細胞株；所述第一定值的判斷標準是指到該第一定值的下一個倍增值時，觀察到細胞大量死亡，細胞狀態(tài)變差，所述第二定值的判斷標準是細胞在該第二定值的反復作用下能夠正常生長，到該第二定值下一個倍增值時細胞增殖不受影響，細胞生長正常。

本發(fā)明中，步驟(1)較佳地在細胞長至貼壁后待融合率達到35～40％時加入篩選藥物；步驟(1)較佳地在連續(xù)作用36～48小時后洗去死細胞并擴增存活的細胞；所述的篩選藥物為臨床上常用的腫瘤化療藥物，較佳地選自5-氟尿嘧啶(5-Fu)、順鉑(CDDP)和羥基喜樹堿(HCPT)中的任一種；所述的藥物的IC₂₀值為臨床上常規(guī)的概念，指誘導腫瘤細胞凋亡20％時該藥物的濃度。

本發(fā)明中，步驟(2)所述將細胞經(jīng)過凍存后復蘇細胞的操作較佳地為在細胞生長良好，細胞對藥物耐受增加，基本不出現(xiàn)凋亡時，將細胞凍存3個月后復蘇細胞。

本發(fā)明中，較佳地，在步驟(1)之前還包括如下步驟：

(a)取生長狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的人口腔鱗癌CAL-27細胞，用胰酶消化計數(shù)；

(b)在細胞培養(yǎng)容器中種植8組細胞，每組3個重復樣品，每個樣品加入細胞數(shù)為8000個，待細胞生長至貼壁；

(c)在含10％FBS的高糖DMEM完全培養(yǎng)基中添加步驟(1)所述篩選藥物形成濃度梯度，并加入對應組別的樣品細胞中，使該篩選藥物對細胞發(fā)揮作用，待藥物作用48小時后，加入MTT孵育4小時，然后加入三聯(lián)溶解液(10％SDS，5％異丁醇，0.01mol/L HCl)溶解，取樣于OD595nm檢測讀值，計算IC₅₀濃度，并根據(jù)IC₅₀濃度的值計算該篩選藥物的IC₂₀濃度。

本發(fā)明中，步驟(a)所述用胰酶消化計數(shù)的操作中，所取的CAL-27細胞的數(shù)量與所用的胰酶數(shù)量之間的比例為本領(lǐng)域常規(guī)，只要胰酶能將待消化的細胞全部覆蓋浸潤即可；優(yōu)選地，所取的CAL-27細胞的數(shù)量與所用的胰酶數(shù)量之間的比例為：每3×10⁶個細胞用1ml 10mol/ml的胰酶消化。

本發(fā)明中，步驟(b)所述的細胞培養(yǎng)容器為本領(lǐng)域常規(guī)，優(yōu)選96孔板。