[發明專利]一種重組副豬嗜血桿菌免疫保護性抗原PotD及其制備方法

在審

• 申請號: 201410640742.0
• 申請日: 2014-11-12
• 公開（公告）號: CN104357458A
• 公開（公告）日: 2015-02-18
• 發明（設計）人: 文心田;文翼平;代科;曹三杰;黃小波;伍銳;張祿滑;周鵬;李英;何綠琴;丁玲強
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/70;C12N1/21;C07K14/285;C12P21/02;C12R1/19
• 代理公司: 成都高遠知識產權代理事務所(普通合伙) 51222
• 代理人: 李高峽;張娟

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體涉及一種重組副豬嗜血桿菌免疫保護性抗原PotD及其制備方法。

背景技術

副豬嗜血桿菌病是由副豬嗜血桿菌(Haemophilus?Parasuis，HPS)引起家豬及藏豬的一種泛嗜性細菌性傳染病，又稱“革拉瑟氏病”(Glasser’s?Disease)。隨著規模化、集約化豬場的發展,副豬嗜血桿菌引起的以豬多發性漿膜炎、關節炎、呼吸困難、高熱及高死亡率為特征的傳染性疾病給養豬業帶來巨大的經濟損失,副豬嗜血桿菌引起的疾病已逐漸成為世界范圍的重要疾病。

我國近年來才開始逐漸重視對副豬嗜血桿菌病的研究。副豬嗜血桿菌的血清型眾多，目前已鑒別十五種血清型，還有15％-41％的未鑒定血清型，其中1，5，10，12，13和14為強毒株，而我國流行的血清型為4型和5。不同血清型的副豬嗜血桿菌毒力差異很大，我們對其毒力因子及致病機理知之甚少，至今尚無有效的通用商品苗和敏感的診斷方法，該病尚未得到有效控制，給全球養豬業帶來巨大的經濟損失。

我國至今沒有像豬瘟兔化弱毒疫苗、偽狂犬基因缺失疫苗那樣的成熟疫苗來針對副豬嗜血桿菌病，目前大多都是傳統型滅活苗和弱毒苗，缺乏良好的保護力，導致臨床病例多見。而滅活疫苗只能對同種血清型的菌株具有保護作用，缺乏交叉保護力。副豬嗜血桿菌血清型的多樣性以及占很大比例的不能分型菌株影響了對具有高效交叉保護力疫苗的研制。亞單位疫苗同時具有活疫苗免疫效力高、交叉保護力強以及滅活苗的安全性好等優點，具有十分廣闊的應用前景。大部分不能分型菌株副豬嗜血桿菌及其血清型的多樣性影響了人們對于具有高效交叉保護力疫苗的研制。

PotD(Polyamine?transport?protein聚胺轉運蛋白)參與大腸埃希氏菌生物膜的形成，屬于ATP-結合匣(ATP-binding?cassette)中的聚胺轉運系統中的一員，該系統包含PotA，B，C和D，他們同屬于亞精胺偏愛性的轉運蛋白；而PotF，G，H和I則屬于鹽酸丁二胺偏愛性的轉運蛋白。聚胺和鹽酸丁二胺則是構成體內多價陰離子化合物的重要組成，普遍存在于包括原核生物在內的生物體內。細胞內聚胺過多或者過少都將造成細胞損害。同時發現，PotABCD中的任何一員缺失，都將導致整個轉運系統無法轉運聚胺，特別是亞精胺^[8]。因此作為聚胺轉運系統中的重要一員，PotD對細菌的生長調節至關重要。

目前未見重組表達PotD基因的報道。

發明內容

為了解決上述問題，本發明提供了一種重組PotD蛋白及其制備方法。

本發明提供了一種如SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列。

本發明重組載體，其特征在于：包含SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列。其中，所述的重組載體是重組pET28a質粒。

本發明重組菌，它包含前述的重組載體。其中，所述的重組菌為重組大腸桿菌。

本發明重組PotD蛋白，它由SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列編碼。它的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示。

本發明制備重組PotD蛋白的方法，包含如下步驟：

ⅰ、取權利要求5所述的重組大腸桿菌組菌，接種到添加有終濃度為50μg/ml的卡拉霉素的LB培養基上，37℃、280r/min搖床培養，至OD₆₀₀值達到0.5～0.6時，加入IPTG至終濃度為0.2～1.5mmol/L，25～42℃誘導表達1～7h；

ⅱ、離心，得菌體，裂解，取上清，分離純化，即得。

步驟ⅰ中，IPTG的終濃度為1.0mmol/L，誘導表達的溫度為30℃；誘導表達的時間為5h。

步驟ⅱ中，分離純化的方法是：取沉淀，用的包涵體洗滌液重懸，離心，棄上清，重復前述步驟2次，即可；其中，包涵體洗滌液包含如下濃度的成分：50mmol/L?Tris－HCl，0.5mol/L?NaCl，2mol/L尿素，2％Triton。

本發明采用基因工程的方式成功的構建了基因工程菌，并表達得到了重組蛋白PotD。該重組蛋白PotD具有良好的免疫原性和保護原性，免疫后產生的PotD特異性抗體水平高，可以顯著保護小鼠抵抗副豬嗜血桿菌血清5型強毒菌株的攻擊，保護率高達80％，可以顯著保護小鼠抵抗副豬嗜血桿菌血清5型強毒菌株的攻擊，可以制備成為亞單位疫苗，預防副豬嗜血桿菌病，臨床應用前景良好。