[發明專利]抑制小鼠MACF1基因表達的shRNA序列及其應用

有效

• 申請號: 201410631379.6
• 申請日: 2014-11-11
• 公開（公告）號: CN104531700B
• 公開（公告）日: 2017-12-29
• 發明（設計）人: 騫愛榮;商澎;胡麗芳;李潤芝;蘇佩紅;印崇;閆琨;陳志浩;戚依朵;孫瑜隆
• 申請（專利權）人: 西北工業大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/867;C12N5/10;A01K67/027
• 代理公司: 西北工業大學專利中心61204
• 代理人: 王鮮凱

技術領域

本發明涉及一種shRNA序列，特別涉及一種抑制小鼠MACF1基因表達的shRNA序列。還涉及這種抑制小鼠MACF1基因表達的shRNA序列的應用。

背景技術

微管微絲交聯因子1(microtubule actin crosslinking factor 1，MACF1)，又名ACF7(Actin crosslinking factor 7)，是一種新的細胞骨架交聯分子，定位于1p31-32上，含有5380個氨基酸，通過調節微絲、微管骨架動力學，在調節細胞遷移、細胞極化、細胞粘附、細胞信號轉導、蛋白質運輸等多種生物學功能中起重要作用。由于MACF1的廣泛分布性及其在多種生物學功能中的重要作用，因此，研究其在不同組織中的功能具有重要意義。

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)誘發的、同源mRNA高效特異性降解的現象。使用RNAi技術可以特異性沉默特定基因的表達，因此，該技術已被迅速而廣泛用于特定基因功能、基因表達調控的研究及相關疾病的基因治療研究領域。小發卡或短發卡RNA(small hairpin RNA或short hairpin RNA，shRNA)是一段具有緊密發卡環的RNA序列，通過載體可將shRNA導入細胞，導入的shRNA發卡結構被細胞機制切割成siRNA，由siRNA發揮作用達到沉默靶基因表達的作用。

文獻1“Chen HJ,Lin CM,Lin CS,Perez-Olle R,Leung CL,Liem RK,The role of microtubule actin cross-linking factor 1(MACF1)in the Wnt signaling pathway,Genes Dev.20(2006)1933–1945.”報道了采用siRNA的技術方法降低了小鼠多能胚胎癌細胞系P19細胞和Rat-1穩定成纖維細胞系中MACF1的表達，并用了蛋白質免疫印跡檢測了該siRNA在降低MACF1表達方面的效率，結果發現轉染后這兩種細胞系中MACF1的表達量降低了～65％。

文獻2“Ka M,Junq EM,Mueller U,Kim WY,MACF1 regulates the migration of pyramidal neurons via microtubule dynamics and GSK-3 signaling,Developmental Biology.395(2014)4–18.”報道中使用shRNA的方法來降低MACF1的表達，同時采用電穿孔轉染方法將針對MACF1的shRNA轉到小鼠大腦皮質細胞中，蛋白質免疫印跡檢測證明shRNA明顯降低了MACF1的蛋白表達。

上述方法均在降低小鼠細胞中MACF1表達方面取得了顯著的效果，但采用上述siRNA方法及電穿孔轉染方法在降低小鼠前成骨細胞系中MACF1的表達時效率較低，且致死率較高，原因主要是小鼠前成骨細胞系MC3T3-E1轉染較為困難。

發明內容

為了克服現有shRNA序列抑制小鼠MACF1基因表達時效率低的不足，本發明提供一種抑制小鼠MACF1基因表達的shRNA序列及其應用。抑制小鼠MACF1基因表達的shRNA序列為：5'-GCTAGTGAATATCCGCAATGATTCAAGAGATCATTGCGGATATTCA CTAGC-3'，其中TTCAAGAGA為loop結構，其作用起始靶點是MACF1基因的第627位點。通過將抑制小鼠MACF1基因表達的shRNA序列克隆至pGLV3慢病毒載體上，得到含有所述shRNA序列的重組慢病毒載體；通過將所得到的重組載體用于轉染小鼠細胞，達到抑制細胞中MACF1基因表達的目的。以上所述shRNA序列可明顯抑制小鼠前成骨細胞中MACF1基因在mRNA及蛋白水平的表達，并且，通過抑制小鼠前成骨細胞中MACF1的表達抑制了前成骨細胞增殖、遷移和分化功能，提高了shRNA序列抑制小鼠MACF1基因表達時的效率。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：一種抑制小鼠MACF1基因表達的shRNA序列，其序列結構是5'-GCTAGTGAATATCCGCAATGATTCAAGAGATCATTGCGGATATTCACTAGC-3'，其中TTCAAGAGA為loop結構。

一種上述抑制小鼠MACF1基因表達的shRNA序列的應用，其特點是：