[發明專利]胰腺癌診斷標記物組合、應用及其測定方法

有效

• 申請號: 201410624200.4
• 申請日: 2014-11-07
• 公開（公告）號: CN105572276B
• 公開（公告）日: 2018-12-18
• 發明（設計）人: 賈偉;謝國祥;劉佳健;趙愛華
• 申請（專利權）人: 上海市第六人民醫院
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88;G01N30/06
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 馮子玲

1.一種胰腺癌診斷標記物組合，其特征在于，為血漿或血清差異性代謝物，包括膽堿、1,5-脫水葡萄糖醇、2,5-二羥基苯甲酸、塔羅糖、脯氨酸、谷氨酸鹽、色氨酸、谷氨酰胺、甜菜堿、2-酮戊二酸、甲胍、腺嘌呤、甘氨膽酸、纈氨酸、2-氨基丁酸；其中谷氨酸鹽可用谷氨酸酯代替。

2.根據權利要求1所述的胰腺癌診斷標記物組合，其特征在于，還包括碳酰胺、肌酐、3-氨基-2-哌啶酮、2,4-二氨基苯甲酸、N-乙酰谷氨酸、吲哚乙酸、1,3,7-三甲基尿酸、尿酸、吲哚丙烯酸、單異丁基鄰苯二甲酸、對羥基苯基丙烯酸、丙酰肉堿、卵磷脂、半乳糖醇、煙酸單核苷酸、2-甲基-3-氧代丙酸。

3.權利要求1或2中所述的胰腺癌診斷標記物組合的應用，其特征在于，用于制備診斷胰腺癌的試劑盒。

4.根據權利要求3所述的胰腺癌診斷標記物組合的應用，其特征在于，所述試劑盒的診斷樣品是血漿或血清。

5.權利要求1或2所述的胰腺癌診斷標記物組合的測定方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1，取胰腺癌病人臨床血漿或者血清樣本和正常人對照血漿或者血清樣本；

步驟2，通過色譜質譜聯用代謝組學分析方法分析鑒定胰腺癌病人臨床血漿/血清樣本和正常人對照血漿/血清樣本的初步差異性代謝物；

步驟3，在多維OPLS-DA模型的變量權重VIP值大于1及非參檢驗的P值小于0.05的選擇標準下，得到進一步差異性代謝物；

步驟4，進行邏輯回歸模型進行驗證，得到差異性代謝物。

6.如權利要求5所述的測定方法，其特征在于，所述步驟1中包括不同地區不同組別的胰腺癌病人臨床血漿/血清樣本和正常人對照血漿/血清樣本。

7.如權利要求5所述的測定方法，其特征在于，所述步驟2中的色譜質譜聯用代謝組學分析方法包括液相/氣相色譜質譜聯用代謝組學分析方法。

8.如權利要求7所述的測定方法，其特征在于，所述步驟2中氣相色譜質譜聯用測試的色譜條件包括：Rxi-5ms毛細管柱：填充5％聯二苯/95％二甲基聚硅氧烷、載氣：超純氦氣、流量：1.0mL/min、進樣口溫度：260℃、傳輸線溫度：260℃、離子源溫度：210℃、進樣量：1μL、進樣方式：不分流進樣、升溫程序：從80℃開始并持續2min，以10℃/min的升溫速度升至220℃，之后以5℃/min的升溫速度升至240℃，再以25℃/min的升溫速度升至290℃，最后在290℃持續8min，質譜離子源：EI源，電子轟擊能量：70eV，質譜掃描范圍：m/z，40-600，全掃描方式。

9.如權利要求7所述的測定方法，其特征在于，所述步驟2中液相色譜質譜聯用測試的色譜條件包括：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱4.6×150mm,5μm，柱溫：30℃。流動相A：水，其中包含0.1％的甲酸；B：乙腈，其中包含0.1％的甲酸，流動相洗脫梯度為0-25min：1-100％B，流速：0.4mL/min，進樣量：10μL。飛行時間質譜優化條件為：(1)正離子模式ES+，毛細管電壓3500V，噴霧器45psig，干燥氣溫度325℃，干燥器流速11L/min；(2)負離子模式ES-，毛細管電壓3000V，其他參數與正離子模式一致。在代謝物譜分析時，數據采集形式為plot和centroid同時進行，采集質量范圍為50-1000Da。

10.如權利要求7所述的測定方法，其特征在于，所述步驟2中氣相色譜質譜聯用測試的血漿/血清樣本前處理包括：取50μL血漿/血清，加入10μl濃度為0.1mg/mL的氯苯丙氨酸水溶液和10μL濃度為1mg/mL的十七酸的醇溶液作為內標來監測樣本的重現性；再加入175μL氯仿甲醇混合溶劑，其中氯仿與甲醇的體積比為1:3，渦旋振蕩30s；置離心管于-20℃放置10min以促進蛋白沉淀；然后13000rpm離心10min，取上清200μL于高回收進樣瓶中，室溫下真空干燥得到樣本品。

11.如權利要求10所述的測定方法，其特征在于，所述步驟2中樣本品經抽干后使用兩步法進行衍生，首先加入50μL濃度15mg/mL的甲氧胺吡啶溶液，渦旋振蕩30s，在30℃下反應90min，然后再加入50μL含1％TMCS的BSTFA在70℃反應60min，靜置后進行GC-TOFMS分析。