[發明專利]花生維生素C合成相關基因AhPMM及其應用

有效

• 申請號: 201410604319.5
• 申請日: 2014-11-03
• 公開（公告）號: CN104372015B
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發明（設計）人: 隋炯明;鄭春花;王亞;趙春梅;孔祥遠;王晶珊;喬利仙
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: C12N15/61
• 分類號: C12N15/61;C12N9/90;A01H5/00
• 代理公司: 青島致嘉知識產權代理事務所(普通合伙)37236
• 代理人: 王曉曉

技術領域

本發明屬于生物技術領域，尤其涉及花生維生素C合成相關基因AhPMM及其應用。

背景技術

維生素C即抗壞血酸，在生物體的氧化還原代謝反應中起調節作用，人類缺乏它可引起壞血病。除此之外,它還具有其他的作用。例如，缺乏維生素C膽固醇就不能羥基化變成膽酸排出體外；它的氧化酶會影響某些氨基酸（一般是芳香族）的代謝；還有解毒作用等。一般，在動物體內和植物體內，維生素C都可以自己合成，但是，在人體卻無法合成抗壞血酸。這是由于，在人體內缺乏古洛內酯氧化酶。植物體自身所合成的維生素C，不僅可以為人類所用，對植物體本身生理功能也具有重要作用。一般來說，抗壞血酸與植物的抗逆性是呈正相關的，隨著植物細胞內的抗壞血酸的含量增加，其本身及其代謝相關酶類在清除活性氧方面的作用也增強，使得抗壞血酸在植物耐炎熱、寒冷和鹽堿環境等逆境的機制中起到了重要的作用。而且抗壞血酸還與植物細胞的分裂、伸長和植株生長有關。

迄今為止已經發現在植物中可能存在4種維生素C合成途徑：半乳糖途徑、糖醛酸途徑、古洛糖途徑以及肌醇途徑。其中在維生素C的主要的生物合成途徑當中，磷酸甘露糖變位酶(PMM)可以促進D-6-磷酸甘露糖轉化為D-1-磷酸甘露糖，從而進一步合成維生素C。

目前在擬南芥、煙草、大豆、水稻、番茄、小麥等已經被克隆了PMM基因，但在花生中還沒有克隆的報道，該基因在花生中的功能性研究和轉基因調控的報道尚存空白。

發明內容

本發明提供了花生維生素C合成相關基因AhPMM及其應用，本發明通過將AhPMM基因轉入花生中，可以顯著提高花生轉基因植株的維生素C含量和花生種子的耐鹽性。

為實現上述發明目的，本發明采用下述技術方案予以實現：

花生維生素C合成相關基因AhPMM，其序列表如SEQ ID No:1所示。

所述基因AhPMM有11個外顯子。

所述11個外顯子對應的堿基分別為第3-71，1246-1290，1410-1476，1784-1860，2076-2111，2207-2262，2349-2448，2549-2644，2732-2821，3204-3255，3417-3472位。

克隆所述基因AhPMM的引物名稱與序列如下：

P1 (5'- AAATGGCTGCCCGGAAACCTGG -3')；

P2 (5'- TGGTGGTTCTCAATGGAAACATTGCT -3')，

上述引物序列分別與基因AhPMM第1-22堿基、第3482-3507堿基對應。

本發明還提供了所述的花生維生素C合成相關基因AhPMM編碼產生的蛋白質，其氨基酸序列表如SEQ ID No:2所示。

本發明還提供了所述的基因AhPMM在提高維生素C含量的應用。

轉AhPMM基因花生葉片總維生素C含量達8.64 umol g^-1，還原態維生素C含量達5.38 umol g^-1。

本發明還提供了所述的基因AhPMM在提高耐鹽性中的應用。

將花生AhPMM基因在花生中超量表達，花生轉基因種子在1% NaCl溶液中發芽率最高達到50%。

與現有技術相比，本發明的優點和積極效果是：

1、本發明從花生中克隆了PMM基因（AhPMM），測序結果表明該基因有11個外顯子，分別對應的堿基為3-71，1246-1290，1410-1476，1784-1860，2076-2111，2207-2262，2349-2448，2549-2644，2732-2821，3204-3255，3417-3472。

2、將所述AhPMM基因轉入花生植株中，轉AhPMM基因花生植株形態發育正常，轉基因花生葉片總維生素C含量可達到8.64 umol g^-1 (FW)，為對照(5.31 umol g^-1)的1.6倍；還原態維生素C含量可達到5.38 umol g^-1 (FW)，為對照(2.83 umol g^-1)的1.9倍。所以本發明將AhPMM基因在花生過量表達可顯著提高葉片維生素C含量。

3、本發明通過實驗證明AhPMM基因受鹽脅迫誘導表達，24 h時可達到對照的4.96倍。

4、轉AhPMM基因花生種子在1% NaCl的發芽率最高可達到50%，而非轉基因種子的發芽率只有20%；本發明將AhPMM基因在花生過量表達可顯著提高種子的耐鹽性。