[發明專利]基于PCR-RFLP鑒定金銀花品系大毛花和雞爪花的方法

有效

• 申請號: 201410599277.0
• 申請日: 2014-10-30
• 公開（公告）號: CN104328180A
• 公開（公告）日: 2015-02-04
• 發明（設計）人: 黃璐琦;袁媛;蔣超;胡添源
• 申請（專利權）人: 中國中醫科學院中藥研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明屬于植物品種鑒定領域，涉及一種基于PCR-RFLP鑒定金銀花品系大毛花和雞爪花的方法，特別涉及一種基于PCR-RFLP鑒定金銀花品系大毛花和雞爪花的試劑盒及其鑒定方法。

背景技術

藥材金銀花的基源植物為忍冬屬植物忍冬Lonicera?japonica?Thunb.,在長期的栽培過程中其形態發生了明顯的變異和分化，形成了很多農家栽培品種或品系。對山東、河南傳統金銀花道地產區進行調查，發現金銀花栽培品系“大毛花”和“雞爪花”是金銀花的主流商品，其原植物形態、藥材性狀、化學成分均存在一定差異?！按竺ā币蚱淙~片和花蕾被毛多而密得名，雞爪花的花蕾細長聚攏，形似雞爪，因而命名為“雞爪花”，其植株腺毛多不發達。由于雞爪花和大毛花的適生長環境不同，民間栽培引種需要先確定其品系。目前人們主要通過傳統的性狀鑒別方法來區分這兩個主流品系，但在幼苗時期，兩個品系金銀花的性狀差別不明顯，且不同產地的金銀花性狀亦有區別。此外，也有研究表明可采用隨機擴增多態性DNA(RAPD)技術和同工酶(POD)電泳分析技術對這兩個品系進行鑒別，但鑒別結果不夠直觀，操作略顯復雜。

雞爪花和大毛花商品價值也有區別，傳統認為，大毛花品系更符合傳統道地產區的特征，價格較高。然而，大毛花和雞爪花苗期形態相似，而市場流通的商品金銀花經由炮制加工、運輸儲藏后，形態有所改變，腺毛脫落，難以區分。因此，急需建立科學性強、使用方便的種質鑒別方法。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種用于鑒定金銀花品系大毛花和雞爪花的試劑盒。

本發明所提供的用于鑒定金銀花品系大毛花和雞爪花的試劑盒，具體含有由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對，以及限制性內切酶MfeI或其同裂酶。

其中，序列1由21個核苷酸組成，序列2由24個核苷酸組成。

所述的試劑盒在鑒定或輔助鑒定待測金銀花為大毛花品系還是雞爪花品系中的應用也屬于本發明的保護范圍。

本發明的另一個目的是提供一種基于限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應(PCR-RFLP)技術鑒定或輔助鑒定待測金銀花為大毛花品系還是雞爪花品系的方法。

本發明所提供的基于PCR-RFLP技術鑒定或輔助鑒定待測金銀花為大毛花品系還是雞爪花品系的方法，具體可包括如下步驟：

(1)以待測金銀花的基因組DNA為模板，采用由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對進行PCR擴增；

(2)采用限制性內切酶MfeI對步驟(1)所得PCR產物進行完全酶切；

所述完全酶切是指酶切體系中所有可以被限制性內切酶Ava?II或其同裂酶識別并酶切的所述PCR產物均被切開，即不存在酶切不完全的情況。

(3)按照如下方法確定所述待測金銀花的品系：若經步驟(2)酶切獲得的DNA片段為如下(a1)，則所述待測金銀花為或候選為大毛花品系；若經步驟(2)酶切獲得的DNA片段為如下(a2)或(a3)，則所述待測金銀花為或候選為雞爪花品系。

(a1)大小分別為102bp和177bp的兩個DNA片段(大毛花純合子)；

(a2)大小為279bp單一DNA片段(雞爪花純合子)；

(a3)大小為102bp、177bp和279bp的三個DNA片段(雞爪花雜合子)。

進一步，所述步驟(3)中，大小為102bp的DNA片段的核苷酸序列為序列表中序列3的第1-102位，大小為177bp的DNA片段的核苷酸序列為序列表中序列3的第103-279位，大小為247bp的DNA片段的核苷酸序列為序列表中序列4。

在實際應用中，判斷酶切產物中是否含有目的DNA片段時，可通過將酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，看電泳圖譜上是否含有目的條帶：電泳圖譜上含有目的條帶，則酶切產物中含有相應的目的DNA片段。

在實際應用中，判斷酶切產物中是否含有序列3的第1-102位、序列3的第103-279位或序列4所示DNA片段，可通過對酶切產物進行核苷酸序列測定來判斷。

在所述方法的步驟(1)中，進行所述PCR擴增時，組成所述引物對的兩條引物在反應體系中終濃度均為80nmol/L。