[發明專利]一種同時檢測12種常見呼吸道病毒的方法

有效

• 申請號: 201410594064.9
• 申請日: 2014-10-29
• 公開（公告）號: CN104342503B
• 公開（公告）日: 2016-11-30
• 發明（設計）人: 王宇平;王凌冰;張建明;黃野能;高博;何冰
• 申請（專利權）人: 福建國際旅行衛生保健中心;新疆國際旅行衛生保健中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 福州智理專利代理有限公司 35208
• 代理人: 王義星

技術領域

本發明屬于分子生物學方法進行病毒檢測領域，具體涉及一種檢測12?種呼吸道病毒的方法。

背景技術

呼吸道病毒是一大類能侵犯呼吸道主要引起呼吸道外組織器官病變的病毒。據統計，90%以上急性呼吸道感染由病毒引起，其中以呼吸道病毒最常見，包括流感病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腺病毒等。并且，近年來新的致病性呼吸道病毒還在不斷地被發現，如偏肺病毒、冠狀病毒、博卡病毒等，給人類的健康構成很大的威脅。急性呼吸道感染大多具有潛伏期短、發病急、感染力強、傳播快等特點，常可導致較高的發病率和死亡率，尤其受到環境變化和生態平衡破壞的影響，病毒易發生各種變異，常突然暴發，病情兇險，死亡率也較高。呼吸道病毒引起的感染癥狀比較相似，難以靠臨床癥狀及常規檢測方法進行明確診斷，因此，迫切需要一種高靈敏度、高特異性的方法進行篩查。

目前，我國常用的呼吸道病毒的檢測方法主要包括以下幾種：1、電子顯微鏡鏡檢?直接對標本中病毒進行形態學鑒定，缺點：①診斷效率低，且有些病毒難以直接從形態學上進行區分；②需要昂貴設備和有經驗操作者。2、病毒分離培養?是病毒診斷“金標準”，缺點：①費時費力，且需要有經驗操作者；②生物安全風險較高。3、免疫學檢查?應用最廣泛的是酶聯免疫技術（ELISA），一般先用一抗與抗原發生特異性結合，然后用通用的酶標記的二抗與一抗發生特異性的結合，再將酶顯色，之后觀察結果；優點：①樣品通量較高，利用96孔酶標板，可以同時完成多個樣本的檢測；②較敏感：利用酶聯的特性，可以將原來的抗原信號放大；③比傳統的培養法縮短時間。缺點：①易出現假陽性；②靈敏度不確定；③病毒抗原發生變異時出現假陰性結果。4?分子生物學—PCR檢測方法：目前經常使用的有PCR、實時熒光定量PCR等，都是針對病毒的特異性靶基因進行檢測。其中，熒光定量PCR檢測方法最為成熟。其優點是：靈敏度高并可以精確定量。但是也存在以下缺點：①通量低，一般一次只能檢測一種病毒，多重熒光檢測時存在熒光干擾影響檢測結果；②檢測成本相對較高。

GenomeLab?GeXP多重基因表達遺傳分析系統基于貝克曼公司成熟的毛細管電泳分離技術及高靈敏度的激光誘導熒光技術研發而成，一束8道的毛細管陳列設計充分利用了96孔板的排列特性。采用多重PCR方法，通過燃料標記，在同一個PCR管中同時分析多個基因的表達，克服了上述呼吸道病毒檢測方法存在的缺陷，具有以下優點：

1、高通量：采用雙96孔板，實現單個反應檢測12個位點，可同時做192個反應，一天出結果；對于交叉感染者，本方法可一次性給出準確報告，避免漏檢。

2、準確性強：本方法采用毛細管電泳對PCR產物進行分離檢測，可以將非特異性擴增產物、引物二聚體和特異性擴增產物分離，最大程度降低假陽性；

3、敏感性高，結果重復性好：本方法克服傳統PCR擴增方法的不均等擴增造成的偏差，提高了對一套目的基因進行定量的速度和敏感性。

4、方法簡便，使用經濟：使用引物混合液，每個樣品檢測12個位點僅需一次加樣；單個樣品的檢測成本低，利于大規模推廣；

5、易于實現自動化。

發明內容

本發明目的是提供一種高通量、高靈敏度和高特異性的針對12?種呼吸道病毒的快速分子生物學檢測方法。

為了實現上述目的本發明采用如下技術方案：本發明所述的一種同時檢測12種常見呼吸道病毒的反轉錄引物組，其特征在于，包括針對?12?種呼吸道病毒和?1?種內對照基因的反轉錄引物，?其序列見表1：

表1

其中博卡病毒和腺病毒無RT引物，1?種內對照基因為人RNA內參，其基因的反轉錄引物為：CGGCATCTTCAAACCTCCAT。

在一種同時檢測12種常見呼吸道病毒的PCR引物組中，包括針對?12?種呼吸道病毒和?3種內對照基因的PCR引物，其序列見表2：

表2

其中博卡病毒和腺病毒有正反PCR引物，3?種內對照基因的PCR引物：①人RNA內參的PCR引物序列為：?GCCGTGTGAACCATGTGAC；②人DNA內參的引物序列為：5’?CGCTAGGAATCAGACCAACAC?和5’?ATGGCGGTGTTTGCAGAT；③反應內參的引物序列為：5’?GCCAGATATACGCGTTGACA?和5’?AGGGCGTACTTGGCATATGAT。