[發明專利]一種同時檢測12種常見呼吸道病毒的方法

有效

• 申請號: 201410594064.9
• 申請日: 2014-10-29
• 公開（公告）號: CN104342503B
• 公開（公告）日: 2016-11-30
• 發明（設計）人: 王宇平;王凌冰;張建明;黃野能;高博;何冰
• 申請（專利權）人: 福建國際旅行衛生保健中心;新疆國際旅行衛生保健中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 福州智理專利代理有限公司 35208
• 代理人: 王義星

1.一種同時檢測12種常見呼吸道病毒的反轉錄引物組，其特征在于，包括針對?12?種呼吸道病毒和?1?種內對照基因的反轉錄引物，?其序列見表1：

表1

其中博卡病毒和腺病毒無RT引物，1?種內對照基因為人RNA內參，其基因的反轉錄引物為：CGGCATCTTCAAACCTCCAT。

2.一種同時檢測12種常見呼吸道病毒的PCR引物組，其特征在于，?包括針對?12?種呼吸道病毒和?3種內對照基因的PCR引物，?其序列見表2：

?表2

其中博卡病毒和腺病毒有正反PCR引物，3?種內對照基因的PCR引物：①人RNA內參的PCR引物序列為：?GCCGTGTGAACCATGTGAC；②人DNA內參的引物序列為：5’?CGCTAGGAATCAGACCAACAC?和5’?ATGGCGGTGTTTGCAGAT；③反應內參的引物序列為：5’?GCCAGATATACGCGTTGACA?和5’?AGGGCGTACTTGGCATATGAT。

3.一種同時檢測12種常見呼吸道病毒的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）選取適當的目的基因相關序列，設計特異性檢測12種常見呼吸道病毒的特異性引物具體的核苷酸序列如下表3：

表3

（2）取被檢樣品提取總核酸；

（3）以提取的總核酸為模板進行反轉錄；

（4）建立RT和PCR?反應體系，將上述引物以及各反應組份置于PCR?儀中，加入被檢樣品提取的DNA模板或反轉錄產物，進行擴增；

（5）以毛細管電泳的方法進行樣品分離、鑒定。

4.根據權利要求3所述的一種同時檢測12種常見呼吸道病毒的方法，其特征在于：所述的反轉錄引物包括10種呼吸道病毒的RT擴增引物和人RNA內參的RT擴增引物，所述的PCR引物包括2種呼吸道病毒的正反向PCR引物、人DNA內參的正反向PCR擴增引物、反應內參的正反向PCR擴增引物以及上述10種呼吸道病毒的PCR擴增引物及人RNA內參的PCR擴增引物。

5.根據權利要求3?所述的一種同時檢測12種常見呼吸道病毒的方法，其特征在于：所述步驟（2）中的被檢樣品包括患者的包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液和痰液。

6.根據權利要求3?所述的一種同時檢測12種常見呼吸道病毒的方法，其特征在于：所述步驟（3），RT反應體系及反應條件為：5-20ng/μL的核酸樣品5μL，DEPC水8μL，5×RT緩沖液4μL，RT引物2μL，RT酶1μL；混勻后進行反轉錄；反應條件是：48℃?1分鐘、42℃?60分鐘、95℃?5分鐘、4℃直至收取RT產物，反轉錄引物溶液中各RT引物的濃度為500nM。

7.根據權利要求3?所述的一種同時檢測12種常見呼吸道病毒的方法，其特征在于：所述步驟（4），PCR反應體系及反應條件：RT產物8.6μL，10×PCR緩沖液2μL，25mM氯化鎂4μL，PCR引物溶液2μL，DNA聚合酶1.4μL，X溶液2μL；混勻后加入到PCR管中進行PCR反應，反應條件是：95℃10分鐘、94℃?30秒、55℃?30秒、70℃?1分鐘，35個循環、70℃?1分鐘、4℃直至收取PCR產物；PCR引物溶液中各種PCR引物濃度均為200nM；所述的X溶液為包括三磷酸脫氧核苷酸和通用引物，所述的通用引物正向擴增引物序列為?GTACGACTCACTATAGGGA反向擴增引物序列為AGGTGACACTATAGAATA，所述的通用引物正向擴增引物帶熒光標記。

8.根據權利要求3??所述的一種同時檢測12種常見呼吸道病毒的方法，其特征在于：所述步驟（5）包括制備遺傳分析儀樣品、準備分離液、毛細電泳分離樣品、結果分析的步驟。

9.根據權利要求3?或4或5或6或7或8?所述的一種同時檢測12種常見呼吸道病毒的方法，其特征在于：所述反應體系設立有陽性對照和陰性對照；所述陽性對照是采用上述12種呼吸道病毒、RNA內參、DNA內參和反應內參的引物的基因基因重組克隆質粒；所述陰性對照是未使用的病毒采樣液。

10.一種同時檢測12種常見呼吸道病毒的試劑盒，其特征在于：包括如權利要求1所述的同時檢測12種常見呼吸道病毒的反轉錄引物組和如權利要求2所述的同時檢測12種常見呼吸道病毒的PCR引物組。