[發(fā)明專利]焦磷酸測序法檢測NPM1基因突變的引物對及試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410579959.5
• 申請日: 2014-10-24
• 公開（公告）號: CN104357557A
• 公開（公告）日: 2015-02-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 邵棠;陳慶;李玲
• 申請（專利權(quán)）人: 南京百捷生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 肖明芳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學領(lǐng)域，具體涉及一種焦磷酸測序法檢測NPM1基因突變的引物對及試劑盒。

背景技術(shù)

核磷蛋白(nucleophosmin，NPM)基因定位于人類染色體5q35，含有12個外顯子，編碼由294個氨基酸組成的NPM蛋白。NPM1參與核糖體的合成和中心體復(fù)制以調(diào)控細胞增殖和周期進程。NPM1突變僅累及第12號外顯子，目前有超過40種不同的突變亞型，其中絕大多數(shù)包含了12號外顯子4個堿基的插入；其中最常見的是NPM1-mutA，占所有突變的75％-80％，它是在野生型NPM1核苷酸序列上第956-959位上插入1個TCTG?4個核苷酸而形成串聯(lián)重復(fù)序列。

NPM1基因突變常見于AML患者中；近來有報道顯示在骨髓增生異常綜合癥(MDS)患者中，也存在著NPM1突變。

當前國內(nèi)外廣泛使用的分子生物學檢測NPM1基因突變的方法中，熒光原位雜交技術(shù)(FISH)只能進行定性檢測、操作復(fù)雜；熒光定量PCR存在著檢測通量的局限性，所以都還不能真正滿足臨床診斷檢測的需要。傳統(tǒng)的固相生物芯片(Biochip)或基因芯片技術(shù)存在著可重復(fù)性差、靈敏度不夠好以及操作繁瑣的突出弱點。

焦磷酸測序技術(shù)(Pyrosequencing)是新一代DNA序列分析技術(shù)，具備同時對大量樣品進行測序分析的能力，為高通量、低成本、快速、直觀地進行核苷酸分析和臨床檢驗提供了非常理想的技術(shù)操作平臺。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題，本發(fā)明提出一種焦磷酸測序法檢測NPM1基因突變的引物對以及含有所述引物對的試劑盒，具有高靈敏度、高特異性、高準確度、檢測迅速等優(yōu)點。

技術(shù)方案：為實現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明提出了一種焦磷酸測序法檢測NPM1突變基因NPM1-mutA的引物對，所述引物對包括：

擴增引物：

上游引物：5′-GTGAAGAATTGCTTCCGGATGACT-3′，

下游引物：5′-ACGGTAGGGAAAGTTCTCACTCTG-3′，

其中下游引物的5′端進行生物素標記；

測序引物：

5′-ACTTCCTCCACTGCC-3′。

本發(fā)明進一步提出了一種焦磷酸測序法檢測NPM1突變基因NPM1-mutA的試劑盒，所述試劑盒包含質(zhì)控品和上述引物對，具體地，所述引物對為：

擴增引物為：

上游引物：5′-GTGAAGAATTGCTTCCGGATGACT-3′，

下游引物：5′-ACGGTAGGGAAAGTTCTCACTCTG-3′，

其中下游引物的5′端進行生物素標記；

測序引物為：

5′-ACTTCCTCCACTGCC-3′。

其中，所述質(zhì)控品包括陽性對照品和陰性對照品。具體地，所述的陽性對照品為陽性對照，具體為含有NPM1-mutA的質(zhì)粒溶液，所述的陰性對照品為陰性對照，其不含NPM1-mutA的質(zhì)粒溶液。

本發(fā)明還提出了上述引物對及包含上述引物對的試劑盒在制備檢測NPM1-mutA的試劑中的應(yīng)用。

有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的焦磷酸測序法檢測NPM1基因突變的試劑盒能夠?qū)崿F(xiàn)快速、簡便、高效、準確的檢測NPM1突變基因NPM1-mutA，為制備用于檢測NPM1-mutA的試劑提供了理論基礎(chǔ)。

具體實施方式

實驗材料：

引物由invitrogen公司合成；Trizol購自invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成試劑盒購置于Fermentas公司；多重PCR試劑盒購置于QIAGEN公司；焦磷酸測序試劑購置于QIAGEN公司。

一種焦磷酸測序法檢測NPM1突變基因NPM1-mutA的試劑盒，包括質(zhì)控品和如下引物：

擴增引物為：

上游引物：5′-GTGAAGAATTGCTTCCGGATGACT-3′，

下游引物：5′-ACGGTAGGGAAAGTTCTCACTCTG-3′，

其中下游引物的5′端進行生物素標記；

測序引物為：

5′-ACTTCCTCCACTGCC-3′。

其中，質(zhì)控品(質(zhì)控品DNA)包括陽性對照品和陰性對照品，所述的陽性對照品作為陽性對照，為含有NPM1-mutA的質(zhì)粒溶液；陰性對照品作為陰性對照，與陽性對照品相比，陰性對照品為不含NPM1-mutA的質(zhì)粒溶液。

檢測方法包括如下步驟：

(一)RNA提取：