[發(fā)明專利]一種檢測大腸桿菌的電化學(xué)傳感器及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410576627.1
• 申請日: 2014-10-24
• 公開（公告）號: CN104407132A
• 公開（公告）日: 2015-03-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 黃加棟;郭玉娜;王玉;劉素;崔敏;李杰;徐偉;王虹智;許穎;崔杰;邱婷婷
• 申請（專利權(quán)）人: 濟南大學(xué)
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 濟南泉城專利商標(biāo)事務(wù)所 37218
• 代理人: 劉麗

技術(shù)領(lǐng)域????

本發(fā)明涉及傳感器技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種檢測大腸桿菌的電化學(xué)傳感器，還涉及一種檢測大腸桿菌的電化學(xué)傳感器的制備方法。

背景技術(shù)???

大腸桿菌屬于革蘭氏陰性菌，學(xué)名大腸希埃氏菌，周身鞭毛，能運動，無芽孢，在自然界中分布十分廣泛，尤其是在溫血動物的腸道和糞便中大量存在。自1885年埃斯克里奇發(fā)現(xiàn)大腸桿菌以后，在此后相當(dāng)長的一段時間內(nèi)大腸桿菌一直被看做無害的非致病菌。隨著研究的進展，人們根據(jù)菌體抗原的不同，將大腸桿菌分為150多型，大多屬于腸道正常菌叢，有16個為致病性大腸桿菌。大腸桿菌對外界環(huán)境中可生存一定時間，因而被糞便污染的土壤、水源可能會含有致病性大腸桿菌。致病性大腸桿菌被嬰兒和幼畜（禽）攝入后可導(dǎo)致嚴重的腹瀉和敗血癥，如非致病性大腸桿菌進入人體膽囊、膀胱等器官也可引起炎癥。大腸菌群值反映了食品等被糞便污染的程度，因而對食品、藥品及飲用水中大腸桿菌菌群數(shù)進行檢測是十分必要的。

檢測大腸桿菌的傳統(tǒng)方法主要有三種，分別是多管發(fā)酵法、濾膜法和平板計數(shù)法，這些方法有儀器操作復(fù)雜，需要專業(yè)操作人員等缺點。

發(fā)明內(nèi)容???

本研究針對現(xiàn)有檢測方法中儀器操作復(fù)雜，需要專業(yè)操作人員的缺點，提供了一種檢測大腸桿菌的電化學(xué)傳感器。

本發(fā)明還提供了檢測大腸桿菌的電化學(xué)傳感器的制備方法。

本發(fā)明是通過以下步驟得到的：

一種檢測大腸桿菌的電化學(xué)傳感器，從內(nèi)到外依次為電極、普魯士藍-碳納米管-納米金復(fù)合物層、大腸桿菌抗體層、牛血清白蛋白封閉層。

所述的電化學(xué)傳感器，優(yōu)選普魯士藍-碳納米管-納米金復(fù)合物層厚度為90±5nm，大腸桿菌抗體層厚度為120±10nm，牛血清白蛋白封閉層厚度為100±10nm。

所述的電化學(xué)傳感器，優(yōu)選普魯士藍-碳納米管-納米金復(fù)合物層是通過以下步驟得到的：

（1）?多壁碳納米管進行羧基化；

（2）制備納米金；

（3）使用步驟（1）和（2）得到的產(chǎn)物制備普魯士藍-碳納米管-納米金復(fù)合物。

所述的電化學(xué)傳感器，優(yōu)選普魯士藍-碳納米管-納米金復(fù)合物中普魯士藍：碳納米管：金質(zhì)量比為2:2:1。

所述的電化學(xué)傳感器，優(yōu)選

（1）電化學(xué)傳感器用磷酸緩沖液沖洗之后，在E.coli溶液中孵育，再次用PBS沖洗，干燥后在大腸桿菌菌液中孵育完全，干燥后滴加HRP標(biāo)記的大腸桿菌抗體，HRP標(biāo)記的抗體通過與目標(biāo)物之間的強識別能力，被修飾在電極表面；

（2）采用三電極系統(tǒng)，以Ag/AgCl為參比電極，以Pt電極為對電極，修飾電極為工作電極，以含對苯二酚和雙氧水的PBS為工作底液采用差分脈沖伏安法檢測，電位設(shè)置為-0.2到0.6?V，脈沖寬度0.05V，脈沖寬度掃描為0.06?S，進行檢測。

所述的電化學(xué)傳感器的制備方法，包括以下步驟：

（1）制備普魯士藍-碳納米管-納米金復(fù)合物，滴加到經(jīng)過處理的電極表面，室溫干燥，得到普魯士藍-碳納米管-納米金復(fù)合物層；

（2）在普魯士藍-碳納米管-納米金復(fù)合物層上滴加無標(biāo)記的大腸桿菌抗體，干燥，得到大腸桿菌抗體層；

（3）在大腸桿菌抗體層外包覆牛血清白蛋白，得到牛血清白蛋白封閉層。

所述的制備方法，優(yōu)選普魯士藍-碳納米管-納米金復(fù)合物的制備方法如下：

1）多壁碳納米管羧基化，

2)制備納米金，

3)?制備普魯士藍-碳納米管-納米金復(fù)合物。

所述的制備方法，優(yōu)選多壁碳納米管羧基化是通過以下步驟得到的：

?稱取200?mg的多壁碳納米管，加入160.0?mL的濃硫酸和濃硝酸的混合液中，其中濃硫酸和濃硝酸的體積比為3：1，混合均勻，離心，離心后倒去上清液加入去離子水水洗，繼續(xù)離心，直到上清液呈中性，干燥即得。

所述的制備方法，優(yōu)選普魯士藍-碳納米管-納米金復(fù)合物是通過以下步驟得到的：

(1)?4?mg羧基化的多壁碳納米管分散到40.0?mL?0.01?M?的FeCl₃溶液中；

(２)邊攪拌邊將40.0?mL?0.01?M的K₃Fe（CN）₆溶液逐滴加入步驟（1）得到的FeCl₃溶液中；

(3)?將步驟（2）得到的溶液在10000?r/min條件下不斷離心，倒去上清液，直到上清液呈無色；